组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
FKBP52 相关蛋白复合物（FKBP52-associated protein complexes）、rpS19 相关蛋白复合物（rpS19-associated protein complexes）；样品基质：293EBNA 细胞裂解液（His6 预浓缩上清）
检测原理
系统将 anti-FLAG IgG 和 streptavidin 分别固定于 SPR 芯片不同流路。His6 预浓缩的 DAP 标签蛋白复合物先经 FLAG 标签与 anti-FLAG 结合，结合质量改变芯片表面折射率，SPR 以 RU 信号实时反映复合物浓度；随后 TEV 蛋白酶切割 FLAG 与诱饵蛋白之间的 TEV 位点，将复合物释放并转移至 streptavidin 流路，经生物素-链霉亲和素二次捕获。重复两轮亲和富集可放大低丰度复合物信号。捕获复合物由 LEP 在芯片上酶切为肽段，肽段在线进入纳流 LC-MS/MS 鉴定。SPR 同时监测结合、释放和消化过程。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
系统通过两步亲和纯化与芯片上酶切，自动化富集细胞裂解液中的低丰度蛋白复合物，提高选择性、减少人工污染并提高重现性。FKBP52 诱饵每轮初始捕获约 3725 RU，四轮二次纯化累计约 354 RU，LEP 消化后回收肽段约 148 RU（148 pg），鉴定出 hsp90 α/β、FKBP52、微管蛋白及 CCT 亚基；rpS19 诱饵初始捕获约 8051 RU，二次纯化累计约 353 RU，回收肽段约 193 RU（193 pg），鉴定出 10 种核糖体蛋白、3 种转录作用因子及 1 种其他蛋白。作者认为其适合蛋白复合物快照分析，但仍需提高覆盖率和回收率。
传感器的构成
- 基底/换能器：CM5 传感器芯片（carboxymethyldextran derivatized surface）与 Biacore 3000 SPR 光学系统，提供结合表面并检测折射率变化
- 偶联修饰层：EDC/NHS 化学偶联体系，将识别元件固定到 CM5 表面
- 识别元件1：anti-FLAG IgG，固定于 FC1-FC2，通过 FLAG 标签捕获蛋白复合物
- 识别元件2：streptavidin，固定于 FC3-FC4，通过生物素化标签进行二次捕获
- 释放元件：TEV protease，切割 FLAG 与诱饵蛋白之间的 TEV 位点，释放复合物
- 消化元件：LEP protease（Achromobacter lyticus protease I），在芯片上酶切蛋白复合物为肽段
- 运行/清洗介质：HEPES/NaCl/OG running buffer、formic acid、water、NaOH/PBS，维持结合、去除非特异结合并洗脱
- 在线读出接口：纳流 LC 捕集柱、Mightysil-C18 分析柱与 Q-TOF MS/MS，用于肽段分离和蛋白鉴定
中文摘要
我们开发了一种新型自动化系统，通过整合表面等离子共振（SPR）生物传感器与高灵敏度纳流液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）来分析蛋白复合物。在哺乳动物细胞中表达同时带有 His 标签、FLAG 标签和生物素化序列的诱饵蛋白；利用 His 标签从细胞裂解液中初步纯化后，将样品蛋白混合物施加到 SPR 生物传感器上，使蛋白复合物捕获在传感器芯片表面。随后自动完成三步操作：（1）利用 FLAG 标签和生物素化标签对蛋白复合物进行芯片上两步纯化；（2）在芯片上对复合物进行蛋白酶消化；（3）对产生的肽段进行在线纳流 LC-MS/MS 分析以鉴定蛋白。上述过程均可由 SPR 生物传感器实时监测。作者分别以 FK506 结合蛋白 52 kDa（FKBP52）或核糖体蛋白 S19（rpS19）为诱饵验证系统性能。结果表明，全自动化 SPR-LC-MS/MS 系统是功能蛋白质组学研究的有力工具，尤其适用于细胞功能复合物和分子机器的快照分析。
英文摘要
We have developed a novel automated system to analyze protein complexes by integrating a surface plasmon resonance (SPR) biosensor with highly sensitive nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). A His-tagged protein, which is also tagged with FLAG and biotinylated sequences, was expressed in mammalian cells. After purification by using the His tag from the cell lysate, the sample protein mixture was applied to an SPR biosensor and the protein complex was captured on the sensor chip. The automated SPR-LC-MS/MS was then performed: (1) two-step on-chip purification of the protein complex by using the FLAG and the biotinylated tags, (2) on-chip protease digestion of the complex, and (3) online nanoflow LC-MS/MS analysis of the resulting peptide fragments for protein identification. All of these processes could be monitored in real-time by the SPR biosensor. We validated the performance of the system using either FK506-binding protein 52 kDa (FKBP52) or ribosomal protein S19 (rpS19) as bait. Thus, the fully automated SPR-LC-MS/MS system appeared to be a powerful tool for functional proteomics studies, particularly for snapshot analysis of functional cellular complexes and machines.