组成图示
点击图片查看大图 · 依据论文自动绘制
传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
黄嘌呤（xanthine）；样品基质：缓冲液标准样品，文中提及可应用于稀释尿液、血浆及食品（肉类/鱼类）
检测原理
黄嘌呤进入溶胶–凝胶多孔基质后，被包埋的黄嘌呤氧化酶（XO）催化氧化，生成尿酸和超氧自由基（O2•−）。超氧自由基随后被超氧化物歧化酶（SOD）催化歧化，生成过氧化氢（H2O2）。H2O2 在辣根过氧化物酶（HRP）催化下氧化非荧光探针 Amplex Red，生成高荧光产物 resorufin。由于每分子黄嘌呤经级联反应可产生一分子 H2O2，并进一步转化一分子 resorufin，荧光强度与黄嘌呤浓度成正比。检测时以 530 nm 激发、590 nm 发射读取荧光信号，信号随黄嘌呤浓度增加而增强。溶胶–凝胶基质保持酶活性并允许底物与中间产物扩散，实现连续多酶反应和荧光换能。
检测灵敏度
LOD: 20 nM（表 1: 0.02 μM）；线性范围: 0–3.5 μM（校准曲线 0–1.06 μM）；R^2 = 0.994（sol–gel）/0.986（free enzymes）
效应效果
该传感器包埋后保持与游离酶相近的催化活性，校准曲线斜率相似，无明显活性损失。稳定性方面，4 ℃缓冲液中保存时，前 12 天保持 100% 初始信号，第 16 天约 75%，第 20 天约 60%，第 24 天约 5%；适当储存下可稳定 2 周。重复使用性方面，同一溶胶–凝胶单体连续检测 0.5 μM 黄嘌呤，前 3 次无活性损失，第 4 次响应降至 63%，第 5 次降至 24%。与表 1 所列现有黄嘌呤生物传感器相比，其 20 nM 检出限和 0–3.5 μM 线性范围灵敏度更高。作者认为可通过样品稀释降低干扰，用于尿液、血浆等生物流体及肉类/鱼类新鲜度评价。
传感器的构成
- 载体/换能介质：TEOS 溶胶–凝胶（sol–gel）单体，形成多孔光学透明无机玻璃，固定酶并允许底物扩散
- 催化识别元件：黄嘌呤氧化酶（XO），催化黄嘌呤氧化为尿酸和超氧自由基
- 催化识别元件：超氧化物歧化酶（SOD），催化超氧自由基歧化生成过氧化氢
- 催化识别元件：辣根过氧化物酶（HRP），催化过氧化氢氧化 Amplex Red 生成 resorufin
- 信号标记物：Amplex Red（N-乙酰-3,7-二羟基苯并氧嗪），非荧光底物，被氧化为高荧光 resorufin
- 反应介质：10 mM 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）与 10 μM Amplex Red 溶液，提供酶反应环境
中文摘要
本文报道了一种用于黄嘌呤定量检测的高灵敏度荧光多酶生物传感器。该传感器通过将黄嘌呤氧化酶（XO）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（HRP）三种酶同时包埋于单一溶胶–凝胶（sol–gel）基质中，并与 Amplex Red 探针偶联构建而成。溶胶–凝胶化学形成多孔且光学透明的基质，能够保持三种共固定蛋白的天然构象和催化活性。黄嘌呤检测基于一系列连续反应：XO 催化黄嘌呤氧化生成尿酸和超氧自由基，SOD 随后催化超氧自由基歧化生成过氧化氢，过氧化氢再与非荧光 Amplex Red 按化学计量反应生成高荧光产物 resorufin。研究优化了传感器的最佳工作条件。结果表明，黄嘌呤浓度在 0–3.5 μM 范围内呈线性响应，检出限为 20 nM，显著提高了现有黄嘌呤生物传感器的灵敏度。所制备传感器可重复使用，并在适当储存条件下稳定保持 2 周。
英文摘要
In this work we report the development of a highly sensitive fluorescent multienzymatic biosensor for quantitative xanthine detection. This biosensor is built by the simultaneous encapsulation of three enzymes, xanthine oxidase, superoxide dismutase and peroxidase, in a single sol-gel matrix coupled to the Amplex Red probe. The sol-gel chemistry yields a porous, optically transparent matrix that retains the natural conformation and the reactivity of the three co-immobilized proteins. Xanthine determination is based on a sequence of reactions, namely catalytic oxidation of xanthine to uric acid and superoxide radical, and subsequent catalytic dismutation of the radical, resulting in the formation of hydrogen peroxide, which reacts stoichiometrically with non-fluorescent Amplex Red to produce highly fluorescent resorufin. The optimal operational conditions for the biosensor were investigated. Linearity was observed for xanthine concentrations up to 3.5 microM, with a detection limit of 20 nM, which largely improved the sensitivity of the current xanthine biosensors. The developed biosensor is reusable and remains stable for 2 weeks under adequate storage conditions.