组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
胞内环磷酸腺苷（cAMP, cyclic AMP）；样品基质：活细胞胞质（人支气管上皮 HBE、人结肠腺癌 Caco-2、Jurkat T 细胞）。
检测原理
该传感器基于PKA的cAMP结合机制。静息状态下，PKA调节亚基RIIβ-CFP与催化亚基Cα-YFP形成全四聚体，CFP与YFP距离接近，发生FRET。当胞内cAMP升高时，cAMP结合RIIβ，使Cα-YFP从复合物中释放，CFP-YFP距离增大，FRET效率下降，CFP发射增强而YFP发射减弱，CFP/YFP比值随cAMP浓度升高而升高。PT、CT和ET分别通过ADP-核糖基化Gi/Gs或直接腺苷酸环化酶活性升高cAMP，从而在活细胞中产生可被430 nm激发、480/540 nm发射采集的比值荧光变化。
检测灵敏度
—
效应效果
在三种细胞系中，20 nM PT使HBE和Jurkat细胞cAMP在约30 min或20–30 min滞后后升高，Caco-2无反应；纯B寡聚体无作用。5 nM CT使三种细胞均出现强cAMP升高，但滞后时间不同，且未见明显胞内梯度。10 nM EF加20 nM PA组成的ET在Caco-2活性弱，在HBE中升高cAMP并形成由核周向周边递减的梯度。25 µM forskolin用于验证细胞响应和信号未饱和。方法可分辨毒素作用的时间动力学与空间分布，并将PT入胞时间从数小时修正为30–40 min。
传感器的构成
- 基底/培养载体：玻璃盖玻片（glass coverslips），用于细胞贴附与倒置荧光显微成像；HBE 培养面用纤连蛋白（fibronectin）、牛血清白蛋白（BSA）和胶原 I 型（collagen type I）包被，Jurkat 用聚-D-赖氨酸（poly-D-lysine）包被。
- 细胞表达平台：人支气管上皮细胞（HBE）、人结肠腺癌细胞（Caco-2）和 Jurkat T 细胞，通过 FuGENE HD 转染或电穿孔表达 FRET cAMP 探针。
- 识别元件：PKA 调节亚基 RIIβ 融合 CFP（pCDNA3-RIIRI-CFP）与 PKA 催化亚基 Cα 融合 YFP（pCDNA3-C-YFP），组成 cAMP 结合型 FRET 探针。
- 信号标记物：CFP 作为 FRET 供体、YFP 作为受体；cAMP 结合后 R-CFP 与 C-YFP 分离，FRET 降低，CFP/YFP 比值升高。
- 读出系统：Olympus IX81 倒置显微镜、MT20 氙灯、Dual-View 分束器、505DCXR 二向色镜、D480/30 与 D535/40 滤光片、F-View II 相机，430 nm 激发并采集 480/540 nm 发射。
中文摘要
本研究利用荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，对三种最常被研究的、可升高胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平的细菌毒素——百日咳毒素（PT）、霍乱毒素（CT）和炭疽水肿毒素（ET）的酶活性进行荧光视频显微成像。将编码蛋白激酶A（PKA）调节亚基与催化亚基分别融合于CFP和YFP的质粒转染至三种细胞系，实时成像获得毒素作用的时间和空间分辨图像。PT诱导的cAMP升高时间过程提示其活性亚基进入胞质的速度比生化实验推断更快。ET产生从细胞核向细胞周边递减的cAMP浓度梯度；而作用于质膜腺苷酸环化酶的CT则未形成明显梯度。文章讨论了成像方法在研究细菌毒素进入方式和胞内作用中的潜力。
英文摘要
The enzymatic activity of the three most studied bacterial toxins that increase the cytosolic cAMP level: pertussis toxin (PT), cholera toxin (CT), and anthrax edema toxin (ET), was imaged by fluorescence videomicroscopy. Three different cell lines were transfected with a fluorescence resonance energy transfer biosensor based on the PKA regulatory and catalytic subunits fused to CFP and YFP, respectively. Real-time imaging of cells expressing this cAMP biosensor provided time and space resolved pictures of the toxins action. The time course of the PT-induced cAMP increase suggests that its active subunit enters the cytosol more rapidly than that deduced by biochemical experiments. ET generated cAMP concentration gradients decreasing from the nucleus to the cell periphery. On the contrary, CT, which acts on the plasma membrane adenylate cyclase, did not. The potential of imaging methods in studying the mode of entry and the intracellular action of bacterial toxins is discussed.