组成图示
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传感器类型
表面等离子共振(SPR)生物传感器
检测对象
RNAI（RNAI发夹RNA）、Rop（Rop同源二聚体蛋白）；样品基质为SPR运行缓冲液（10 mM磷酸钠pH 7.2、140 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM DTT、0.005% P20，5°C）
检测原理
将3'生物素标记RNAII通过链霉亲和素固定于SPR金膜芯片，形成固定配体表面。流动相注入RNAI后，RNAI与RNAII通过loop-loop相互作用形成瞬时kissing complex，表面结合质量增加，SPR共振单位（RU）上升；随后注入不同浓度Rop，Rop识别并稳定RNAI-RNAII复合物，形成Rop-RNAI-RNAII三元复合物，进一步增加表面质量。由于Rop结合会显著降低RNAI从RNAII解离速率，传感器图表现为衰减表面或稳定表面。通过kinetic titration、全局拟合和Scatchard分析，从RU随时间/浓度变化获得kon、koff、Kd及1:1化学计量。
检测灵敏度
未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或R^2。
效应效果
该SPR方法在5°C下成功解析了不稳定RNAI-RNAII kissing complex与Rop的相互作用。RNAI-RNAII的Kd为43±2 nM，kon=8.2±0.3×10^5 M^-1 s^-1，koff=351±1×10^-4 s^-1；Rop结合Kd为31±4 nM（动力学）和28±1 nM（Scatchard），kon=3.6±0.4×10^6 M^-1 s^-1，koff=0.11±0.03 s^-1，化学计量为1:1。Rop使RNAI从RNAII解离慢110倍，证明其稳定复合物。结果与凝胶电泳、NMR、荧光及UV数据一致，并首次给出速率常数；Rop对TAR-aptamer复合物Kd为3.6 µM，弱129倍，显示结构特异性。
传感器的构成
- 基底/换能器：SPR金膜传感芯片（SA sensorchip，Biacore）与BIAcore 3000，提供表面等离子共振光学换能
- 固定化层：链霉亲和素（streptavidin, SA）涂层，用于特异性捕获生物素化RNAII
- 识别元件/固定配体：3'生物素-TEG标记RNAII（biotinylated RNAII），固定于SA表面并作为RNAI识别靶标
- 识别元件/流动相分析物：RNAI发夹RNA，与RNAII通过loop-loop相互作用形成kissing complex
- 识别元件/流动相分析物：Rop同源二聚体蛋白，识别并稳定RNAI-RNAII kissing complex
- 信号读出：SPR共振单位（RU）实时监测表面结合质量变化，BiaEval 4.1进行动力学拟合
中文摘要
RNA环-环复合物是原核和真核生物中调控生物学功能的重要结构基序。在大肠杆菌中，ColE1质粒编码的反义RNA RNAI通过环-环相互作用识别RNAII，后者是结合质粒DNA并启动复制的RNA引物，从而调控质粒复制。质粒编码的同源二聚体蛋白Rop可与这一瞬时RNAI-RNAII kissing complex相互作用。本研究采用表面等离子共振（SPR）生物传感器，在5°C下实时研究该蛋白-核酸三元复合物，分别考察Rop结合正在解离的环-环复合物以及结合饱和稳定RNAI-RNAII表面的两种实验条件。结果表明，存在Rop时RNAI发夹从RNAII表面的解离速率比无Rop时慢110倍。Rop与RNAI-RNAII的结合速率常数为3.6×10^6 M^-1 s^-1，解离速率常数为0.11 s^-1，平衡解离常数为31 nM。Scatchard图分析证实Rop与RNAI-RNAII形成1:1复合物，这与非天然Rop-环-环复合物的结果一致。
英文摘要
RNA loop-loop complexes are motifs that regulate biological functions in both prokaryotic and eukaryotic organisms. In E. coli, RNAI, an antisense RNA encoded by the ColE1 plasmid, regulates the plasmid replication by recognizing through loop-loop interactions RNAII, the RNA primer that binds to the plasmidic DNA to initiate the replication. Rop, a plasmid-encoded homodimeric protein interacts with this transient RNAI-RNAII kissing complex. A surface plasmon resonance (SPR)-based biosensor was used to investigate this protein-nucleic acid ternary complex, at 5 degrees C, in experimental conditions such as the protein binds either to the loop-loop complex while it dissociates or to a saturated stable RNAI-RNAII surface. The results show that RNAI hairpin dissociates from the RNAII surface 110 times slower in the presence of Rop than in its absence. Rop binds to RNAI-RNAII with an on-rate of 3.6 x 10(6) M(-1) s(-1) and an off-rate of 0.11 s(-1), resulting in a binding equilibrium constant equal to 31 nM. A Scatchard-plot analysis of the interaction monitored by SPR confirms a 1:1 complex of Rop and RNAI-RNAII as observed for non-natural Rop-loop-loop complexes.