组成图示
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传感器类型
全细胞生物传感器
检测对象
活性氧（ROS）、线粒体氧化应激（MOS）；样品基质：高糖培养的人视网膜微血管内皮细胞（HREC）及糖尿病大鼠视网膜色素上皮（RPE）组织
检测原理
高糖或糖尿病状态下，线粒体电子传递链产生过量超氧化物等活性氧（ROS），形成线粒体氧化应激（MOS）。ROS 氧化 Keap1 的巯基，使其对 Nrf2 的抑制解除，Nrf2 进入细胞核并结合 ARE-GFP 构建体中的抗氧化反应元件（ARE）重复序列，启动下游 EGFP 报告基因转录。随着 ROS/MOS 水平升高，ARE 激活增强，EGFP 表达量增加，绿色荧光强度随之升高。纳米颗粒将 ARE-GFP 递送至细胞或视网膜组织，利用细胞自身转录机制实现识别与基因表达放大；CM-H2TMRos 进入线粒体后被氧化而荧光增强，直接报告 MOS。最终通过共聚焦显微镜或流式细胞仪读取荧光信号。
检测灵敏度
未报告
效应效果
体外实验中，5、10、30 和 55 mM 葡萄糖处理人视网膜微血管内皮细胞（HREC）显示 MOS 和 ARE-GFP 激活均呈剂量依赖性；30 mM 组 MOS 阳性细胞比 10 mM 组高 1.3 倍以上，55 mM 组增幅最大，超过 2 倍，且多数 GFP 阳性细胞同时呈 MOS 阳性，提示传感器对高糖诱导氧化应激具有选择性响应。体内实验中，纳米颗粒经视网膜下注射成功递送，糖尿病大鼠视网膜色素上皮（RPE）中 EGFP 阳性细胞明显多于非糖尿病大鼠，表明构建体在体内可报告糖尿病相关 ARE 激活。作者认为该方法可用于监测糖尿病视网膜等组织的氧化状态。
传感器的构成
- 递送纳米载体：链霉亲和素包被磁性纳米颗粒（streptavidin-coated magnetic nanoparticles, MNP），结合生物素化 ARE-GFP 片段并介导视网膜下注射递送
- 基因识别元件：生物素标记的 ARE-GFP PCR 片段（ARE-GFP construct），含抗氧化反应元件（ARE）重复序列、最小胸苷激酶启动子（TK promoter）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因
- 细胞内识别元件：Nrf2 转录因子与 Keap1 抑制蛋白，在活性氧（ROS）/氧化应激下解除抑制并结合 ARE
- 信号标记物：增强型绿色荧光蛋白（EGFP），ARE 激活后转录表达，产生绿色荧光
- 辅助检测探针：CM-H2TMRos 线粒体氧化应激荧光探针和 Hoechst 33342 核染料，用于 MOS 与细胞定位验证
- 信号读出装置：多光谱共聚焦显微镜（Zeiss 510 META）或流式细胞仪（BD FACScan），采集 EGFP 荧光
中文摘要
细胞自身的抗氧化反应元件（ARE）可用于评估糖尿病并发症。本文检验了合成 ARE 能否作为基因开关或生物传感器，用于开启或关闭治疗基因。线粒体氧化应激（MOS）被认为是糖尿病最早损伤之一。用于监测 MOS 的荧光探针显示，将葡萄糖以生理水平加入内皮细胞培养体系即可诱导高于正常水平的 MOS，并呈剂量依赖性。进一步数据显示，葡萄糖水平升高可剂量依赖性激活 ARE-GFP。这些结果支持 MOS 诱导对高血糖比 ARE 诱导更敏感。利用纳米颗粒将 ARE-GFP 构建体经视网膜下注射递送至眼内成功，且该 ARE-GFP/纳米颗粒构建体具有功能，能报告糖尿病大鼠视网膜色素上皮（RPE）中 ARE 的激活。这些数据支持使用纳米颗粒递送生物传感器在体内监测组织氧化状态。
英文摘要
The cell's own antioxidant response element (ARE) can be used to evaluate the complications of diabetes mellitus. The hypothesis that a synthetic ARE could be used as a genetic switch, or biosensor, to turn on and off therapeutic genes is tested herein. Mitochondrial oxidative stress (MOS) has been hypothesized as one of the earliest insults in diabetes. Fluorescent probes used to monitor MOS revealed that the addition of glucose at physiological levels to cultures of endothelial cells was able to induce MOS above normal levels and in a dose-dependant manner. Additional data showed that increased glucose levels activated the ARE-GFP in a dose-dependant manner. These data support the hypothesis that the induction of MOS is more sensitive to hyperglycemia than the induction of the ARE. Delivery of an ARE-GFP construct with nanoparticles to the eye was successful using sub-retinal injection. This ARE-GFP/nanoparticle construct was functional and reported the activation of the ARE in diabetic rat retinal pigment epithelium (RPE). These data support the use of nanoparticle-delivered biosensors for monitoring the oxidative status of tissues in vivo.