组成图示
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传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
无明确被测物；发光底物为 coelenterazine（海肾素），样品基质包括 PBS 缓冲液、E. coli 细胞/裂解体系、拟南芥幼苗。
检测原理
RLUC 以海肾素（coelenterazine）为底物，在分子氧存在下催化氧化脱羧反应，打开咪唑环并释放 CO2，生成处于激发态的海肾酰胺（coelenteramide）。激发态产物退激时发射约 470 nm 蓝光，光子强度由 luminometer 读取为 RLU。初始发光强度与酶浓度、酶活性及底物供给相关；随着底物消耗和产物 coelenteramide 积累，酶受到竞争抑制，发光随时间衰减。本文通过 Pro220、K189V、V267I、M185V 等突变提高 kcat、延长发光半衰期并降低高底物抑制，从而增强报告与传感应用中的信号稳定性。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。
效应效果
论文未报告选择性、抗干扰、RSD 或实际样品加标回收率。体外活性以野生型为 100：V267I 163±33，K189V 128±16，RLUC+ 317±82，SuperRLUC 411±113；hRLUC 体系中 K189V 175±70，M185V+K189V 425±120，SuperhRLUC 475±130。SuperRLUC 三突变体 kcat 提高约三倍，体外发光半衰期约为野生型两倍，且对高底物抑制更不敏感。拟南芥中 SuperhRLUC 发光约为 hRLUC 两倍（P<0.01），Western blot 显示蛋白积累相近。作者认为其可改善报告蛋白、生物传感器和 BRET 供体应用。
传感器的构成
- 非传感器论文：未报道具体传感器器件或电极结构
- 表达宿主：E. coli BL21(DE3) 用于 RLUC 突变体表达与纯化
- 植物表达系统：拟南芥稳定转化株用于体内发光检测
- 发光底物：coelenterazine（海肾素）作为 RLUC 催化底物
- 信号酶：RLUC/RLUC+/SuperRLUC/SuperhRLUC 催化发光
- 检测仪器：luminometer/spectroluminometer 读取 RLU 或光谱
中文摘要
Renilla 荧光素酶（RLUC）是基因表达和生物传感器应用中常用的报告酶，但其稳定性较差，催化机制尚未完全阐明。作者通过底物滴定发现，一个 RLUC 分子可催化约 100 个海肾素（coelenterazine）底物分子。活性位点 Pro220 突变延长了光子发射半衰期，使大肠杆菌中的发光更强。随机突变筛选发现两个新突变，可在体内和体外稳定并增强光子发射，同时减轻底物抑制。结合先前鉴定突变后，新的三突变体 kcat 提高约三倍，并在拟南芥中表现出更高发光。该工作提升了 RLUC 作为报告蛋白、生物传感器或共振能量供体的应用潜力。
英文摘要
Renilla luciferase (RLUC) is a popular reporter enzyme for gene expression and biosensor applications, but it is an unstable enzyme whose catalytic mechanism remains to be elucidated. We titrated that one RLUC molecule can turn over about one hundred molecules of coelenterazine substrate. Mutagenesis of active site residue Pro220 extended the half-life of photon emission, yielding brighter luminescence in E. coli. Random mutagenesis uncovered two new mutations that stabilized and increased photon emission in vivo and in vitro, while ameliorating substrate inhibition. Further amended with a previously identified mutation, a new triple mutant showed a threefold improved kcat, as well as elevated luminescence in Arabidopsis. This advances the utility of RLUC as a reporter protein, biosensor, or resonance energy donor.