组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
cAMP（cyclic AMP，环磷酸腺苷）；样品基质：活细胞内/细胞质（in vivo 细胞环境）
检测原理
该探针为遗传编码 FRET 荧光传感器：cAMP 结合域 B 作为识别元件，CFP 与 YFP 分别连接其 N/C 端作为供体/受体。cAMP 结合时，结合域构象稳定，两个荧光团间距保持约 9 nm 以上，FRET 效率低，供体发射强、受体发射弱；cAMP 解离后，结合域发生构象转变，C 螺旋脱离结合口袋，N/C 端相互靠近，荧光团间距减小，FRET 效率升高，表现为供体荧光下降、受体荧光上升。取向因子动态变化但贡献较小，距离是主要决定因素。信号通过荧光光谱或活细胞成像读出。
检测灵敏度
—
效应效果
本文未提供实验 LOD、线性范围、选择性、稳定性或回收率数据。计算验证显示，隐式溶剂 GB 模拟与显式溶剂 PKARIIb 模拟定性一致，均复现 cAMP 解离引起的结合域分离；但时间尺度加快，显式约 16 ns 的过程在隐式中少于 400 ps，采样提高约两个数量级。结合态结构稳定，荧光团最小间距约 9 nm，FRET 低；游离态荧光团可运动，间距波动产生 FRET 峰。取向因子 k2 在 0–4 间均匀采样，结合态与游离态拟合截距约 1.1 和 1.05，偏离 2/3。作者认为该方法可用于理性设计活体荧光传感器。
传感器的构成
- 识别元件：PKA 调节亚基 RPKAIIb 的 cAMP 结合域 B（RPKAIIb cAMP-binding domain B，PDB 1CX4 残基 264–403），结合 cAMP 并发生构象变化。
- 荧光供体/受体模块：CFP–YFP 荧光蛋白对（模拟中以两个 YFP 拷贝近似 CFP/YFP，PDB 1YFP），分别连接在 cAMP 结合域 N 端和 C 端，作为 FRET 供体与受体。
- 连接/支架：cAMP 结合域 N/C 端与荧光蛋白之间的蛋白连接区（linker/termini），传递构象变化并决定荧光团间距。
- 被测物结合位点：cAMP 结合口袋（cAMP-binding pocket），结合 cAMP 稳定结构，未结合时 C 螺旋脱离导致两端靠近。
- 信号读出：FRET 荧光效率（donor/acceptor fluorescence），通过荧光光谱/成像读取，距离缩短时 FRET 增强。
中文摘要
活体荧光成像已成为追踪细胞内多种分子事件时空定位的有力工具。基于 Förster 共振能量转移（FRET）的遗传编码荧光指示剂被常规使用，但调控其功能的分子基础尚未完全阐明。本文以蛋白激酶 A 调节亚基的 cAMP 结合域为基础，介绍一种常用 cAMP FRET 传感器的结构与动力学性质。采用隐式溶剂分子动力学模拟，定位 cAMP 驱动构象转变的主要特征，并解析决定生物传感器功能的几何因素贡献。模拟表明，取向因子虽非完全各向同性，但高度动态，使荧光团间距离成为决定探针功能的主导因素。作者预期，这种计算机辅助方法可为体内成像荧光标记物的理性设计提供一般性基础。
英文摘要
Fluorescent imaging in vivo has became one of the most powerful tools to follow the temporal and spatial localization of a variety of intracellular molecular events. Genetically encoded fluorescent indicators using the FRET effect are routinely used although the molecular basis regulating their functioning is not completely known. Here, the structural and dynamics properties of a commonly used FRET sensor for the second messenger cAMP based on the cAMP-binding domains of the regulatory subunit of Protein Kinase A are presented. Molecular dynamics simulations allowed pinpointing the main features of cAMP driven conformational transition and dissecting the contributions of geometric factors governing the functioning of the biosensor. Simulations suggest that, although orientational factors are not fully isotropic, they are highly dynamic making the inter-chromophore distance the dominant feature, determining the functioning of the probes. It is expected that this computer-aided methodology may state general basis for rational design strategies of fluorescent markers for in vivo imaging.