组成图示
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传感器类型
荧光生物传感器
检测对象
细胞内环磷酸鸟苷（intracellular cyclic GMP, cGMP）；样品基质：活细胞（小鼠 F9 畸胎瘤胚胎细胞，表达 Frizzled-2/Fz2）
检测原理
Cygnet-2.1 由催化失活牛 PKG Iβ 突变体（Δ1-77/T516A）与 eCFP、citrine 融合。胞内 cGMP 结合 PKG Iβ 后引起构象变化，改变 eCFP 供体与 citrine 受体的距离/取向，调节 FRET 效率。cGMP 升高中断 FRET，525/475 nm 比率降低；cGMP 下降则 FRET 增强，比率升高。共聚焦显微镜以 458 nm 激发，采集 475/525 nm 发射并计算比率，实现活细胞 cGMP 实时、亚细胞定位检测。Wnt5a 经 Fz2/Gβt2/p38/PDE6 降低 cGMP，使比率升高；未用化学放大，依靠比率型 FRET 提高信噪比。
检测灵敏度
未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
在稳定表达 Fz2 的 F9 活细胞中，Cygnet-2.1 可实时监测 Wnt5a（50 ng/ml）诱导的 cGMP 下降。8-Br-cGMP（100 μM）升高胞内 cGMP 时，525 nm 发射明显下降，验证 FRET 比率与 cGMP 呈反向关系。Wnt5a 刺激后，525/475 nm FRET 比率在约 100 min 内逐步升高，信号主要富集于细胞膜附近。SB203580（2 μM）或 p38α siRNA 可消除 Wnt5a 引起的 FRET 响应，表明该传感器能分辨 p38 依赖的 cGMP 变化。文中未报告 LOD、线性范围或 RSD；配套 cGMP ELISA 批内/批间变异系数为 7.5% 和 9.8%。
传感器的构成
- 成像基底：玻璃底培养皿（glass-bottomed dish），承载细胞并支持共聚焦成像。
- 细胞基质：小鼠 F9 畸胎瘤胚胎细胞（F9 cells，稳定表达 Frizzled-2/Fz2），提供胞内 cGMP 检测环境。
- 识别元件：Cygnet-2.1 中的催化失活突变体 Δ1-77/T516A 牛 cGMP 依赖性蛋白激酶 Iβ（PKG Iβ），高亲和结合 cGMP 并发生构象变化。
- 荧光供体：增强型青色荧光蛋白（eCFP），与 PKG Iβ 融合，提供 475 nm 供体发射。
- 荧光受体：citrine（pH 不敏感 YFP），与 PKG Iβ 融合，提供 525 nm 受体发射。
- 信号读出：Zeiss LSM 510 META 共聚焦显微镜，458 nm 激发，525/475 nm 双发射比率成像。
中文摘要
非经典 Wnt/环磷酸鸟苷/钙离子/NF-AT 通路经由 G 蛋白偶联受体 Frizzled-2 发挥作用。作者在小鼠 F9 畸胎瘤胚胎细胞中扫描 Wnt5a 激活 Frizzled-2/Gβt2/PDE6 后的下游事件，发现丝裂原活化蛋白激酶 p38（MAPK p38）被强烈激活。p38 激活对 Frizzled-2 介导的 NF-AT 转录激活必不可少；Wnt5a 诱导的 p38 激活迅速，并受百日咳毒素、针对 Gβt2 或 p38α 的 siRNA 以及 p38 抑制剂 SB203580 抑制。利用 Cygnet-2.1 生物传感器实时监测胞内环磷酸鸟苷，发现 p38 作用于环磷酸鸟苷水平，位于胞内钙动员上游。FRET 成像显示 Wnt5a 引起的环磷酸鸟苷变化主要分布于细胞膜附近，且对 p38 siRNA 或 SB203580 敏感。Dishevelled 并非 Wnt5a 激活 p38 所必需；靶向 Dishevelled 的 siRNA 和 Dapper-1 表达均不能抑制 p38 响应。该研究首次阐明一条 Dishevelled 非依赖的 Wnt 响应，证明 p38 在调控 Wnt 非经典通路中的关键作用。
英文摘要
The non-canonical Wnt/cyclic GMP/Ca(2+)/NF-AT pathway operates via Frizzled-2, a member of the superfamily of G protein-coupled receptors. In scanning for signaling events downstream of the Frizzled-2/G alpha t2/PDE6 triad activated in response to Wnt5a, we observed a strong activation of the mitogen-activated protein kinase p38 in mouse F9 teratocarcinoma embryonal cells. The activation of p38 is essential for NF-AT transcriptional activation mediated via Frizzled2. Wnt5a-stimulated p38 activation was rapid, sensitive to pertussis toxin, to siRNA against either G alpha t2 or p38 alpha, and to the p38 inhibitor SB203580. Real-time analysis of intracellular cyclic GMP using the Cygnet2 biosensor revealed p38 to act at the level of cyclic GMP, upstream of the mobilization of intracellular Ca(2+). Fluorescence resonance energy transfer (FRET) imaging reveals the changes in cyclic GMP in response to Wnt5a predominate about the cell membrane, and likewise sensitive to either siRNA targeting p38 or to treatment with SB203580. Dishevelled is not required for Wnt5a activation of p38; siRNAs targeting Dishevelleds and expression of the Dishevelled antagonist Dapper-1 do not suppress the p38 response to Wnt5a stimulation. These novel results are the first to detail a Dishevelled-independent Wnt response, demonstrating a critical role of the mitogen-activated protein kinase p38 in regulating the Wnt non-canonical pathway.