Imaging alterations of cardiomyocyte cAMP microdomains in disease.
3′,5′-环腺苷酸（cAMP）是调节心脏功能的重要第二信使，其作用具有明确的亚细胞微区室特异性。近年来，借助先进的生化与生物物理技术，研究者对区室化 cAMP 信号及其与心脏疾病的关系获得了更深入的机制认识。本迷你综述总结了该领域最新进展，并综合不同研究数据，构建目前已发现的心肌细胞 cAMP 微区室在代偿性心脏肥大和慢性心力衰竭...
Myelin-associated glycoprotein modulates apoptosis of motoneurons during early postnatal development via NgR/p75(NTR) receptor-mediated activation of RhoA signaling pathways.
髓鞘相关糖蛋白（MAG）是神经髓鞘的次要成分，选择性表达于轴周髓鞘。MAG 通过结合包括 Nogo 受体（NgR）在内的多种轴突受体，对其包裹的轴突发挥滋养和保护作用。药理学激活 NgR 对 p75NTR 依赖的出生后运动神经元（MN）凋亡具有调节作用，但 NgR 是否在 MN 发育中发挥生理作用尚不清楚。NgR 是包含 p75NT...
A practical method for monitoring FRET-based biosensors in living animals using two-photon microscopy.
多光子显微镜系统的商业化推动了活体显微镜在完整动物细胞生物学研究中的应用，而基于荧光蛋白（FP）的生物传感器可实时监测多种细胞过程。Förster 共振能量转移（FRET）探针是检测细胞事件最灵敏的指标之一，但双光子激发（2PE）与单光子激发的差异使活体 2PE FRET 测量仍具挑战。本文提出一种简化 FRET 生物传感器用于活体...
Quantitative analysis of recombination between YFP and CFP genes of FRET biosensors introduced by lentiviral or retroviral gene transfer.
基于 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器可用于在活细胞中可视化信号分子的时空动态。许多分子内 FRET 传感器以青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）分别作为供体和受体。然而，由于 YFP 与 CFP 基因之间重组率高，利用慢病毒或逆转录病毒基因转移建立稳定表达 YFP/CFP FRET 传感器的细胞系仍较...
Actin remodeling by Nck regulates endothelial lumen formation.
多种血管生成信号通过调控磷酸酪氨酸信号促进血管发生与血管生成。尽管其功能与临床意义重要，血管细胞如何整合磷酸酪氨酸依赖信号以引发内皮形态发生所需的细胞骨架变化仍不清楚。Nck适配蛋白家族将磷酸酪氨酸信号与肌动蛋白动力学偶联，因而可能协调血管形成与重塑所需的细胞过程。作者将内皮细胞在含VEGF刺激的三维胶原基质中培养，并结合分子遗传学...
A local VE-cadherin and Trio-based signaling complex stabilizes endothelial junctions through Rac1.
内皮细胞间连接维持限制性屏障，并受促血管生成因子、炎症介质和黏附白细胞等刺激动态调控。这些刺激引起黏附连接暂时重塑，依赖 Rho-GTPase 控制的细胞骨架重排，但鸟苷酸交换因子（GEF）如何在内皮黏附连接处时空调控 Rho-GTPase 活性仍不清楚。本文鉴定 Rho-GEF Trio 在稳定基于血管内皮（VE）-钙黏蛋白（VE...
Spatial Separation of Plk1 Phosphorylation and Activity.
Polo-like kinase 1（Plk1）是控制有丝分裂和细胞分裂的关键激酶。Plk1 在 S 期首先被招募到中心体，在 G2 晚期出现在动粒上，并在有丝分裂末期转位至中央纺锤体。Plk1 的激活需要 Aurora A 对其 T210 位点进行磷酸化，该过程依赖共因子 Bora。然而，关于 Plk1 最初在何处被激活存在争议：...
Large Scale Bacterial Colony Screening of Diversified FRET Biosensors.
基于荧光蛋白突变体之间 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器已广泛用于生理学与生物化学研究，但许多 FRET 传感器在亚最优实验条件下 FRET 变化较小，测量困难。当前领域的重要任务之一是开发新的优化策略。本文报道了通过细菌菌落大规模筛选突变体 FRET 传感器文库来优化 FRET 变化的方法。作者优化了传感器表达...
Molecular mechanism of vinculin activation and nanoscale spatial organization in focal adhesions.
黏着斑连接细胞外基质与肌动蛋白骨架，介导细胞黏附、迁移、机械感知和信号转导。黏着斑具有保守的纳米尺度蛋白组织，提示蛋白在黏着斑中的位置调控其活性与功能。vinculin 结合不同黏着斑蛋白以介导不同细胞功能，但其相互作用在黏着斑内如何时空组织尚不清楚。作者利用干涉光激活定位超分辨显微镜检测 vinculin 纳米定位，并利用 FRE...
The primary cilium functions as a mechanical and calcium signaling nexus.
初级纤毛是多数哺乳动物细胞表面的非运动性天线状结构，在软骨、骨和肾等组织的化学与机械感知中起关键作用。肾上皮中流致细胞内钙离子升高依赖初级纤毛及纤毛定位的钙通透通道多囊蛋白-2（PC2）和瞬时受体电位香草酸4（TRPV4），但骨细胞机械转导的分子机制尚不清楚。作者将基于荧光共振能量转移（FRET）的钙离子生物传感器与初级纤毛特异性蛋...
Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins.
荧光共振能量转移（FRET）型传感器通过配体结合改变两个荧光蛋白之间的距离和取向，将识别事件转换为荧光光谱变化。本研究报道，将分析温度提高到通常高于50°C的临界温度，可显著提高以细菌周质结合蛋白（PBP）为识别元件的FRET糖类传感器信号强度。其机制是临界温度下背景信号突然降低，而在存在配体时最大FRET比率得以恢复。以麦芽糖结合...
Rapid and Localized Mechanical Stimulation and Adhesion Assay: TRPM7 Involvement in Calcium Signaling and Cell Adhesion.
本研究开发了一种基于细胞基底形变的机械刺激装置和一种更灵敏的细胞黏附测量方法。精确定位于细胞附近的探针可实现垂直局部机械刺激，频率约207 Hz，应变幅度约50%。该装置用于检测人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的钙信号响应。细胞内钙离子浓度通过基因编码的Cameleon生物传感器测量，同时抑制瞬时受体电位阳离子通道M亚家族成员7（T...
Activation of α7 nicotinic acetylcholine receptors increases intracellular cAMP levels via activation of AC1 in hippocampal neurons.
α7 烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nAChR）激活可改善海马依赖学习记忆，但机制不清。我们此前报道其激活以 PKA 依赖方式增强谷氨酸能突触传递。本研究用 FRET 生物传感器通过活细胞成像直接测量海马神经元胞内 cAMP。结果显示，在 α7 nAChR 正性变构调节剂 PNU-120596 存在下，α7 选择性激动剂胆碱使 F535...
Synonymous modification results in high-fidelity gene expression of repetitive protein and nucleotide sequences.
重复核苷酸或氨基酸序列常被工程化到探针和生物传感器中，以实现功能读出和稳健信号放大，但这些重复序列极易发生异常缺失和降解，影响生物功能的正确检测与解释。本文提出一种简便且可推广的方法，通过修饰靶 mRNA 的核苷酸序列，使其成为非重复但仍具功能的“同义”序列。作者首先设计一组同义 MS2 RNA 基序和串联衣壳蛋白用于 RNA 成像...
pH sensitivity of FRET reporters based on cyan and yellow fluorescent proteins.
通常认为，遗传编码报告蛋白中常用的青色和黄色荧光蛋白在接近生理pH范围内具有强pH敏感性。我们研究了这些pH响应对在活BHK细胞胞质中表达的模型FRET串联体和基于FRET的cAMP依赖性蛋白激酶活性报告蛋白（AKAR）胞内信号的影响，并通过尼日里菌素离子载体改变胞内pH。尽管供体和受体的同时pH敏感性在某些情况下可能相互掩盖，但与...
Development of a molecularly evolved, highly sensitive CaMKII FRET sensor with improved expression pattern.
基因编码的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器已被成功用于在活细胞中可视化蛋白质活性。FRET 测量的敏感性和准确性直接取决于生物传感器的折叠效率、表达模式、灵敏度和动态范围。为提高 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IIα（CaMKIIα）FRET 传感器的折叠效率，作者利用易错聚合酶链式反应（PCR）扩增 CaMKIIα 基因...
Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors.
转基因小鼠在现代生物医学研究中具有重要作用，不仅可用于解析特定基因和蛋白功能，还可作为表达荧光生物传感器的工具，在活细胞中实时报告第二信使水平和生化过程。本章提供构建质粒载体并生成表达FRET生物传感器的转基因小鼠的详细方案。该传感器为基于Förster共振能量转移（FRET）的cAMP生物传感器Epac1-camps，由cAMP结...
ROZA-XL, an improved FRET based biosensor with an increased dynamic range for visualizing zeta associated protein 70 kD (ZAP-70) tyrosine kinase activity in live T cells.
基因编码的FRET生物传感器可在活细胞中实时观察特定酶活性的空间与时间变化。作者此前报道了特异性识别Zeta相关蛋白70 kD（ZAP-70）的FRET生物传感器；ZAP-70是Syk家族蛋白酪氨酸激酶，对早期T细胞受体（TCR）信号、T淋巴细胞发育以及整合素介导的T细胞迁移至关重要。为便于研究免疫突触形成或细胞迁移等动态过程中的Z...
Application of a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensor for detection of drug-induced apoptosis in a 3D breast tumor model.
二维培养常用于药物测试，但难以反映肿瘤内部细胞的空间相互作用；三维培养可模拟实体瘤结构，却难以长期评估药物效应，因此需要实时、纵向分析平台。本研究将编码荧光共振能量转移（FRET）生物传感器的质粒 DNA 转染人乳腺癌细胞，建立 MCF7-C3 和 MDA-MB-231-C3 细胞系，用于检测 caspase-3 激活。健康细胞呈绿...
DENND2B activates Rab13 at the leading edge of migrating cells and promotes metastatic behavior.
小 GTP 酶 Rab13 参与上皮细胞外泌体囊泡运输，其活性改变与人类癌症相关，但激活机制及在肿瘤进展中的作用不清。本研究鉴定 DENN 结构域蛋白 DENND2B 为 Rab13 的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），并开发一种基于 Förster 共振能量转移（FRET）的新型 Rab13 生物传感器，用于在活细胞中实时监测 Ra...