组成图示
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传感器类型
比色生物传感器
检测对象
乙醇（ethanol, EtOH）；样品基质：gasohol 汽油乙醇混合燃料、酒精饮料、发酵介质
检测原理
乙醇进入固定化酒精氧化酶（AOD）微反应器后，被氧化为乙醛并生成过氧化氢（H2O2）。随后 H2O2 进入固定化辣根过氧化物酶（HRP）微反应器，在 HRP 催化下与 4-氨基苯吖啶和苯酚发生氧化偶联，生成 monoimino-p-benzoquinone-4-phenazone 有色产物。该产物在 470 nm 处具有特征吸收，吸光度随乙醇浓度增加而增大，从而按 Lambert–Beer 定律实现定量。FIA/SIA 微反应器通过连续流动或停流控制反应时间，停流可增强信号；在线或离线稀释用于扩展线性范围并降低高浓度样品干扰。
检测灵敏度
FIA-I: LOD: 4.1×10−2 g ethanol/l；检测范围: 0.05–1.5 g ethanol/l；R = 0.9909。FIA-II: LOD: 9.4×10−3 g ethanol/l；线性范围: 0.001–0.023 g ethanol/l；检测范围: 0.001–0.066 g ethanol/l；R = 0.9897。FIA-III: LOD: 9.5×10−3 g ethanol/l；线性范围: 0.001–0.033 g ethanol/l；检测范围: 0.001–0.087 g ethanol/l。FIA-IV-I: LOD: 8.3×10−3 g ethanol/l；检测范围: 0.033–0.127 g ethanol/l。FIA-IV-II: LOD: 8.4×10−3 g ethanol/l；线性范围: 0.010–0.047 g ethanol/l；检测范围: 0.010–0.047 g ethanol/l；R = 0.9992。SIA-I: LOD: 2.1×10−3 g ethanol/l；线性范围: 0.005–0.04 g ethanol/l；检测范围: 0.005–0.1 g ethanol/l；R = 0.9922。
效应效果
系统重现性良好，光学比色避免电化学电子转移干扰，FIA 在线稀释系统最大相对误差为 12%，SIA 系统为 2%。SIA 停流策略下固定化双酶 3 天后保留 60% 活性，但第 1 天损失约 20%；可连续 2 天复用并完成 60 次测定。温度升高使信号下降，25°C 吸光度 0.1105±0.0007，45°C 降至 0.0313±0.0015。实际样品与 HPLC 结果一致：红色汽油乙醇稀释样相对偏差 12.7%，白葡萄酒最大 7.3%，发酵介质 4.7%。方法无需复杂前处理，仅需稀释，试剂和样品用量低，适合生物燃料、食品和发酵过程质量控制。
传感器的构成
- 换能器/读出基底：470 nm 比色计（colorimeter）与 FIA/SIA 流通管路，用于检测有色产物吸光度
- 微反应器：丙烯酸（acrylic）微反应器，空体积 0.91 mL，长径比 3:1，用于容纳固定化酶并实现连续或停流反应
- 固定化载体：氨基丙基玻璃珠（aminopropyl glass beads, 80–120 mesh），经 2.5% 戊二醛（glutaraldehyde）处理，用于固定 AOD 和 HRP
- 识别/催化元件：酒精氧化酶（alcohol oxidase, AOD），固定于第一微反应器，将乙醇氧化为乙醛并生成 H2O2
- 信号催化元件：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP），固定于第二微反应器或游离注入，催化 H2O2 参与显色反应
- 显色底物/信号标记：4-氨基苯吖啶（4-aminophenazone）和苯酚（phenol），在 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7）中与 H2O2 生成有色产物
- 载液/缓冲液：0.1 M 磷酸钠缓冲液（sodium phosphate buffer, pH 7），作为载液、稀释液和反应介质
中文摘要
本文报道了基于双酶比色反应的不同集成生物传感器系统，用于乙醇检测。系统分别采用流动注射分析（FIA）和顺序注射分析（SIA），将酒精氧化酶（AOD）和辣根过氧化物酶（HRP）固定于玻璃珠微反应器中，或采用固定AOD并注入游离HRP的方式。乙醇被AOD氧化生成过氧化氢，HRP催化过氧化氢与4-氨基苯吖啶和苯酚反应生成有色产物，在470 nm处进行比色测定。FIA单微反应器系统检测范围为0.05–1.5 g/L，相关系数0.9909；双微反应器系统检测范围为0.001–0.066 g/L，1:7000稀释后为0.010–0.047 g/L，相关系数分别为0.9897和0.9992。SIA停流系统线性范围为0.005–0.04 g/L，相关系数0.9922。该系统可用于汽油乙醇混合燃料、酒精饮料和发酵介质中乙醇的快速、低试剂消耗分析。
英文摘要
Different integrated systems with a bi-enzymatic biosensor, working with two different methods for ethanol detection--flow injection analysis (FIA) or sequential injection analysis (SIA)--were developed and applied for ethanol extracted from gasohol mixtures, as well as for samples of alcoholic beverages and fermentation medium. A detection range of 0.05-1.5 g ethanol/l, with a correlation coefficient of 0.9909, has been reached when using FIA system, working with only one microreactor packed with immobilized alcohol oxidase and injecting free horseradish peroxidase. When using both enzymes, immobilized separately in two microreactors, the detection ranges obtained varied from 0.001 to 0.066 g ethanol/l, without on-line dilution to 0.010-0.047 g ethanol/l when a 1:7,000 dilution ratio was employed, reaching correlation coefficients of 0.9897 and 0.9992, respectively. For the integrated biosensor SIA system with the stop-flow technique, the linear range was 0.005-0.04 g/l, with a correlation coefficient of 0.9922.