组成图示
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传感器类型
比色生物传感器
检测对象
N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl homoserine lactones, AHLs），包括 C4-AHL、C6-AHL、C7-AHL、C8-AHL、C10-AHL、C12-AHL、C14-AHL、3-oxo-C6-AHL、3-oxo-C8-AHL；样品基质为 KH2PO4 缓冲液标准品、细菌培养上清/裂解物、fosmid 克隆培养物，可拓展至环境样品。
检测原理
检测原理基于 AHL 生物传感器菌的无细胞转录翻译体系。外源 AHL 进入 KH2PO4 缓冲液中的细胞裂解液后，与 pCF218 编码的 TraR 受体蛋白结合，形成 AHL/TraR 复合物；该复合物结合 traR 启动子，诱导 pCF372 携带的 lacZ 报告基因转录。裂解液保留 70S 核糖体、tRNA、翻译因子、ATP/GTP 等组分，可在体外同步完成转录与翻译，生成 β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶裂解 X-Gal 产生蓝色沉淀，635 nm 吸光度随 AHL 浓度升高而增加；若使用 Beta-Glo，则裂解后产生化学发光。报告基因表达构成信号放大，发光底物进一步提高灵敏度。
检测灵敏度
LOD: X-Gal 比色约 100 nM–300 nM（取决于 AHL）；Beta-Glo 发光最低诱导浓度：oxo-C8-AHL 10±3 nM、oxo-C6-AHL 17±2 nM、C8-AHL 20±2 nM、C7-AHL 25±5 nM、C6-AHL 30±3 nM、C10-AHL 100±5 nM、C12-AHL 200±6 nM；比色最低诱导浓度：oxo-C8-AHL 120±10 nM、oxo-C6-AHL 180±25 nM、C7-AHL 245±8 nM、C8-AHL 225±11 nM、C6-AHL 335±10 nM、C10-AHL 1,300±20 nM、C12-AHL 2,400±30 nM；C4-AHL 与 C14-AHL 未检出；C8-AHL 吸光度变化至 2 μM 呈比例。
效应效果
该无细胞检测在 2–3 h 内完成，显著短于全细胞生物传感器通常需 16–18 h 培养再加 16–18 h 孵育的流程。发光法比 X-Gal 比色法灵敏约 10 倍，最低可检测 oxo-C8-AHL 10 nM、C8-AHL 20 nM；比色法最低可检测 oxo-C8-AHL 120 nM、C8-AHL 225 nM。体系对 C4-AHL 和 C14-AHL 不敏感，显示一定 AHL 谱选择性。裂解液可 -80°C 保存 6 个月，适合批量制备。在 500 个 fosmid 克隆筛查中，24 个呈阳性，并经 LC-MS 确认产生 C6、oxo-C6、C8、C10 和 C12-AHL。作者认为该方法简单、低成本，可用于细菌、环境样品及宏基因组文库的高通量 AHL 筛查。
传感器的构成
- 反应基底/缓冲体系：20 mM KH2PO4 缓冲液（pH 6.5–7.0），提供无细胞转录翻译反应介质。
- 无细胞功能层：根癌农杆菌 NTL4(pCF218)(pCF372) 细胞裂解液（CFL），含 70S 核糖体、tRNA、氨酰-tRNA 合成酶、翻译因子、ATP/GTP、Mg2+/K+。
- 识别元件：TraR 受体蛋白（pCF218 编码），特异性结合 AHL 并形成 AHL/TraR 复合物。
- 报告基因元件：traR 启动子驱动的 lacZ 融合基因（pCF372 编码 traI-lacZ），受 AHL/TraR 复合物诱导转录。
- 信号标记物：X-Gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside）显色底物，被 β-半乳糖苷酶裂解生成蓝色沉淀。
- 替代信号标记物：Beta-Glo 发光底物，被 β-半乳糖苷酶裂解产生化学发光信号。
- 读出层：微孔板读数仪/分光光度计（635 nm）或发光计，输出吸光度或发光强度。
中文摘要
本研究开发了一种简单、灵敏且快速的无细胞检测系统，用于检测细菌群体感应中的 N-酰基高丝氨酸内酯（AHL）自诱导物。该方法改进了以往基于全细胞生物传感器的检测策略，采用 AHL 生物传感器菌根癌农杆菌 NTL4(pCF218)(pCF372) 的细胞裂解液作为无细胞反应体系。当外源 AHL 加入后，裂解液中的 TraR 受体与 AHL 结合并激活 traR 启动子，驱动 β-半乳糖苷酶基因表达。使用显色底物 X-Gal 时，β-半乳糖苷酶裂解 X-Gal 生成蓝色沉淀，可在 635 nm 处比色检测；不同 AHL 的检测限约为 100–300 nM。将 X-Gal 替换为发光底物 Beta-Glo 后，对 AHL 的灵敏度提高约 10 倍。该无细胞体系消除了全细胞生物传感器检测前耗时的细胞培养与条件化步骤，使检测时间从 24 h 以上缩短至 3 h 以内，同时保持较高灵敏度。裂解液可批量制备并在 -80°C 保存 6 个月，也可适配其他生物传感器菌株，用于细菌或宏基因组文库的高通量 AHL 筛查。
英文摘要
A simple, sensitive, and rapid cell-free assay system was developed for detection of N-acyl homoserine lactone (AHL) autoinducers involved in bacterial quorum sensing (QS). The present approach improves upon previous whole-cell biosensor-based approaches in its utilization of a cell-free assay approach to conduct bioassays. The cell-free assay was derived from the AHL biosensor bacterium Agrobacterium tumefaciens NTL4(pCF218)(pCF372), allowing the expression of beta-galactosidase upon addition of exogenous AHLs. We have shown that beta-galactosidase expression is possible in cell-free solution [lysate from Agrobacterium tumefaciens NTL4(pCF218)(pCF372) culture]. Assay detection limits with the use of chromogenic substrate X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) ranged from approximately 100 nM to 300 nM depending on the specific AHL. Replacement (of X-Gal) with the luminescent substrate Beta-Glo increased sensitivity to AHLs by 10-fold. A major advantage of the cell-free assay system is elimination of time-consuming steps for biosensor cell culture conditioning, which are required prior to whole-cell bioassays. This significantly reduced assay times from greater than 24 h to less than 3 h, while maintaining high sensitivity. Assay lysate may be prepared in bulk and stored (-80 degrees C) over 6 months for future use. Finally, the present protocol may be adapted for use with other biosensor strains and be used in high-throughput AHL screening of bacteria or metagenomic libraries.