组成图示
示意图生成中
传感器类型
综述或非传感器论文
检测对象
核糖体蛋白L1及其突变体（ribosomal protein L1, TthL1/TthL1d1/MjaL1）；样品基质：体外纯化蛋白溶液与固定化23S rRNA探针（TMN缓冲液）
检测原理
SPR传感芯片上先固定Neutravidin，再捕获生物素化的79 nt 23S rRNA片段作为识别探针。将不同浓度的野生型或突变L1蛋白注入流动池，蛋白与固定RNA探针结合后，芯片界面质量/折射率发生变化，产生响应单位（RU）信号。结合相信号上升，解离相信号下降；对五组浓度传感器图进行1:1双分子模型全局拟合，得到kass、kdiss和KD。点突变引起β9–β10环等接触区构象变化，形成表面凸起并破坏氢键网络，使复合物解离加快，因此信号解离相下降更快，KD升高。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或 R^2。
效应效果
选择性：5S rRNA阴性对照显示T217A TthL1与非特异RNA的kdiss=3.00×10^-2 s^-1、KD=2.59×10^-5 M，显著不同于23S rRNA特异结合（kdiss=3.15×10^-4 s^-1、KD=1.53×10^-8 M），说明突变体仍特异识别靶位点。稳定性：T217V TthL1d1的kass由9.50×10^5降至4.23×10^4 M^-1s^-1，kdiss由1.42×10^-5升至2.24×10^-2 s^-1，KD升至5.28×10^-7 M；T204F MjaL1的KD由2.72×10^-13升至4.97×10^-11 M。未报告RSD、回收率或ELISA对比。作者认为表面凸起不阻碍识别，但降低复合物寿命。
传感器的构成
- 基底/换能器：ProteOn NLC 传感芯片（聚合物结合层，SPR 光学换能）
- 固定化层：Neutravidin 固定于聚合物层，用于捕获生物素化 RNA
- 识别探针：生物素化 79-nt 23S rRNA 片段（含 L1 结合位点，固定于芯片）
- 阴性对照探针：生物素化 5S rRNA（用于非特异结合对照）
- 分析物：野生型或突变核糖体蛋白 L1（TthL1、TthL1d1、MjaL1 等）
- 缓冲/再生体系：TMN buffer（50 mM Tris-HCl pH 7.5、5 mM MgCl2、350 mM NaCl、0.005% P20）与 SDS 再生液
- 信号读出：SPR 响应单位（RU）随界面结合质量变化
中文摘要
本文以能特异性结合23S rRNA靶位点的核糖体蛋白L1为模型，研究蛋白表面接触区形状互补性改变对蛋白–RNA亲和力的影响。作者将普遍保守的Thr–Met–Gly三联体中参与RNA识别的Thr217分别替换为Phe、Val和Ala，并测定了TthL1d1 Thr217Val突变体的晶体结构，与野生型及此前报道的突变体结构进行比较。利用表面等离子共振（SPR）生物传感器分析测定突变L1与79 nt 23S rRNA片段结合的表观结合和解离速率常数。结果显示，突变主要导致解离速率常数显著升高，结合速率常数变化较小；尽管蛋白表面出现1–2 Å凸起并破坏形状互补性，突变体仍能特异性识别RNA靶位点，但形成的L1–RNA复合物稳定性明显低于野生型。
英文摘要
The formation of a specific and stable complex between two (macro)molecules implies complementary contact surface regions. We used ribosomal protein L1, which specifically binds a target site on 23S rRNA, to study the influence of surface modifications on the protein-RNA affinity. The threonine residue in the universally conserved triad Thr-Met-Gly significant for RNA recognition and binding was substituted by phenylalanine, valine and alanine, respectively. The crystal structure of the mutant Thr217Val of the isolated domain I of L1 from Thermus thermophilus (TthL1) was determined. This structure and that of two other mutants, which had been determined earlier, were analysed and compared with the structure of the wild type L1 proteins. The influence of structural changes in the mutant L1 proteins on their affinity for the specific 23S rRNA fragment was tested by kinetic experiments using surface plasmon resonance (SPR) biosensor analysis. Association rate constants undergo minor changes, whereas dissociation rate constants displayed significantly higher values in comparison with that for the wild type protein. The analysed L1 mutants recognize the specific RNA target site, but the mutant L1-23S rRNA complexes are less stable compared to the wild type complexes.