组成图示
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传感器类型
化学发光生物传感器
检测对象
蛋白酶活性（protease activity）、雷帕霉素（rapamycin）、环磷酸腺苷（cAMP）；样品基质：HEK293T 活细胞内
检测原理
传感器由基因编码的改造萤火虫荧光素酶（Fluc）构成，其 N/C 端经环状排列移至铰链区。关闭态下铰链受阻，荧光素（luciferin）无法有效结合与氧化，发光接近零。当蛋白酶切割识别序列、雷帕霉素竞争性移除或 cAMP 结合变构位点时，铰链阻碍解除，酶闭合并催化荧光素氧化，产生化学发光。信号强度随激活程度增加，从近零基线升至约20倍，实现高动态范围和高信噪比读出。
检测灵敏度
原文未报告LOD、线性范围、灵敏度斜率或R^2；报告信号变化约20倍（~20-fold），酶活保留约75%（~75%）。
效应效果
作者指出传统 FRET 基因编码传感器动态范围通常仅30%至2倍，而该化学发光探针在 HEK293T 活细胞中实现约20倍发光变化，信噪比和动态范围显著改善；设计可通过替换蛋白酶识别序列、辅因子结合域或变构元件推广，适用于大孔板高通量筛选，提高活细胞功能靶标筛选特异性和多路复用能力。未报告 RSD、回收率或稳定性数据。
传感器的构成
- 表达系统：HEK293T 活细胞，承载基因编码传感器并维持生理环境
- 基因表达载体：编码改造萤火虫荧光素酶（Fluc）及调控元件的 DNA，实现组成型或诱导型表达
- 换能酶：改造萤火虫荧光素酶（modified firefly luciferase, Fluc），经环状排列（circular permutation）将 N/C 端移至铰链区，保留约75%野生型酶活
- 识别元件：蛋白酶识别序列（protease recognition sequence），响应蛋白酶切割并解除铰链阻碍
- 识别元件：雷帕霉素结合域（rapamycin binding domain），通过小分子结合/移除调控酶构象
- 识别元件：cAMP 变构位点（cAMP allosteric site），结合环磷酸腺苷诱导闭合构象
- 信号底物：荧光素（luciferin），在激活态被氧化产生化学发光
- 读出信号：化学发光（luminescence），用于高通量筛选（HTS）
中文摘要
新型基因编码生物传感器利用改造的萤火虫荧光素酶，有望在活细胞中显著提升信噪比与响应动态范围。该类传感器在关闭状态下通过铰链结构阻碍荧光素酶与底物荧光素结合，仅在蛋白活性状态触发构象闭合时催化荧光素氧化并发光，从而获得接近零背景与数倍至二十倍以上的信号变化。由于响应特性优异，其特别适用于大孔板格式的高通量筛选，并可通过替换蛋白酶识别序列、辅因子结合域或变构元件，推广至多种细胞内蛋白活性检测，有助于扩展活细胞体系中可筛选靶标范围。相比传统 FRET 荧光蛋白传感器，其动态范围更大，有利于在生理条件下对功能靶标进行活细胞筛选。
英文摘要
New genetically encoded biosensors utilizing the modified firefly luciferase promise a great improvement in the signal-to-noise ratio and the dynamic range of response in living cells. These biosensors are particularly suitable for high-throughput screening assays that use large-well-capacity formats because of their excellent response characteristics. The biosensor design strategies are highly generalizable and will be extremely valuable for expanding the repertoire of screenable targets in living cell systems.