组成图示
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传感器类型
化学发光生物传感器
检测对象
茶碱（theophylline）；样品基质：体外无细胞翻译反应液（含 0–1 mM 茶碱）
检测原理
该传感器以茶碱依赖 aptazyme 作为识别元件，以抑制 tRNA 和突变荧光素酶基因作为信号转导与报告元件。无茶碱时，aptazyme 与 supT 形成 AST，5′端额外结构阻止 SerRS 对 supT 氨酰化，核糖体在 S60UAG 的 UAG 处停滞，不产生有活性 luciferase。茶碱结合 aptazyme 后诱导其自切割，释放成熟 supT；SerRS 将其氨酰化，氨酰化 supT 竞争进入停滞核糖体并抑制 UAG，使翻译继续至终止 UAA，合成全长 luciferase。luciferase 催化化学发光底物产生 CL 信号，信号强度随茶碱浓度升高而增强。该过程通过无细胞翻译将 RNA 开关状态转换为蛋白表达，实现无标记、低检测器依赖的传感。
检测灵敏度
原文未报告 LOD、线性范围、灵敏度斜率或相关系数。
效应效果
该传感器在 1 mM 茶碱下，AST3 的 ON/OFF 效率为 6.8±1.1；经 helix A 长度优化并引入错配后，AST4m 的 ON/OFF 效率为 11.6±1.2，约为 AST3 的两倍，且表现出较高茶碱依赖性。作者认为其效率略高于或可与其他茶碱依赖 aptazyme 相当，但低于原始 aptazyme，原因包括额外序列降低核酶活性、翻译温度略高及 Mg2+ 浓度略低。系统无需标记 aptazyme 或特殊检测器，部分情况下可无检测器读取，具有向活细胞基因调控应用扩展的潜力；文中未报告选择性、抗干扰、稳定性、RSD 或实际样品回收率。
传感器的构成
- 反应体系/换能介质：RF1-free reconstituted prokaryotic cell-free translation system（PURESYSTEM custom, Post Genome Institute），含 T7 RNA polymerase（T7RNAP）、核糖体与氨基酸，提供无细胞转录翻译环境
- 识别元件：theophylline-dependent aptazyme（茶碱依赖 aptazyme），结合茶碱后发生自切割，将结合事件转换为 RNA 结构变化
- 信号转导元件：anticodon-adjusted suppressor tRNA^SerU CUA（supT），与 aptazyme 5′端连接形成 AST，被 SerRS 氨酰化后抑制 UAG 密码子
- 报告基因：amber-mutated luciferase gene（S60UAG），含 UAG 琥珀密码子，无目标时翻译停滞，有目标时合成全长 luciferase
- 信号酶：luciferase（荧光素酶），催化 luciferase assay reagent 中的底物产生化学发光
- 读出试剂：luciferase assay reagent（Promega），提供化学发光底物
- 读出仪器：Wallac 1420 ARVOsx 与 Las4000，测量化学发光强度或成像
中文摘要
本文报道了一种新型无标记、基于 aptazyme 的生物传感器。该传感器将茶碱依赖 aptazyme 连接到琥珀密码子抑制 tRNA^SerU CUA 的 5′端，形成 aptazyme–suppressor tRNA 共轭物（AST），并与含 UAG 琥珀密码子的突变荧光素酶报告基因（S60UAG）共同置于无 RF1 的原核无细胞翻译体系中。无茶碱时，AST 5′端额外序列使抑制 tRNA 不能被氨酰-tRNA 合成酶识别和氨酰化，核糖体在 UAG 处停滞，不产生有活性荧光素酶；茶碱结合后诱导 aptazyme 自切割，释放并激活抑制 tRNA，使其被 SerRS 氨酰化并掺入停滞核糖体，翻译继续至终止密码子，产生全长荧光素酶。通过优化 helix A 长度并引入错配，AST4m 传感器在 1 mM 茶碱下 ON/OFF 效率达 11.6±1.2，约为 AST3 的两倍，具有较高茶碱依赖性，且无需标记或特殊检测器，可潜在用于活细胞基因调控。
英文摘要
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