Shedding new light on RhoA signalling as a drug target
小GTP酶RhoA是细胞与细胞外基质相互作用信号的关键调控因子，参与迁移、机械转导等过程，并在癌变中常发生紊乱。传统生化方法难以在天然组织环境中评估RhoA活性。作者开发了一种RhoA-FRET生物传感器小鼠，利用活体成像的高时空分辨能力监测RhoA活性。该小鼠采用改造型Raichu-RhoA报告蛋白，以EGFP和mRFP替代原CF...
Optimized FRET Pairs and Quantification Approaches To Detect the Activation of Aurora Kinase A at Mitosis.
遗传编码 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器是实时感知细胞内信号转导时空动态的关键工具。随着对多条信号通路串扰研究的深入，FRET 生物传感器需要进一步优化，以便在单细胞中同时监测多种生化活性，并在传感器丰度较低时仍能检测其激活。本文报道了第二代 Aurora 激酶 A（AURKA）FRET 生物传感器的开发。首先，...
Genetically Encoded FRET-Based Tension Sensors.
遗传编码的 FRET（Förster 共振能量转移）张力传感器可测量活细胞或完整生物体中单个分子上的皮牛级力学张力。这类生物传感器在无张力时具有相对较高的 FRET 效率，当施加力时 FRET 效率迅速下降。本文描述如何针对特定目标蛋白构建此类传感器，并讨论用于确认所观察到的 FRET 效率差异确实反映分子张力变化的对照实验。由于所...
pH-Lemon, a Fluorescent Protein-Based pH Reporter for Acidic Compartments.
不同亚细胞pH水平，尤其是溶酶体和内体中的pH，对大分子的降解、修饰、分选、积累和分泌至关重要。本研究通过融合pH稳定的青色荧光蛋白mTurquoise2（mT2）与高pH敏感的增强黄色荧光蛋白EYFP，工程化了一种新型基因编码pH探针。该探针形成比率型生物传感器pH-Lemon，适用于活细胞酸性区室中不同pH条件的成像。酸性条件下...
Direct imaging of the recruitment and phosphorylation of S6K1 in the mTORC1 pathway in living cells.
了解工作细胞中的蛋白质信号通路是开发靶向药物的重要途径。近年 mTOR 通路因在多种疾病治疗中的重要性而备受关注。本研究聚焦 mTORC1 下游磷酸化底物 S6 激酶 1（S6K1），并鉴定其与 mTORC1 的空间邻近关系。当 S6K1 与 raptor 共表达时，S6K1 由细胞核向细胞质转位。作者开发了一种新型生物传感器，实时...
Epigenetic Process Monitoring in Live Cultures with Peptide Biosensors.
乙酰转移酶属于转移酶，负责将乙酰基从乙酰辅酶A转移到组蛋白赖氨酸残基的氨基。以往组蛋白乙酰化监测多依赖生化分析，无法以动态形式提供时空信息。本文提出一种新方法，利用时间相关单光子计数荧光寿命成像（TCSPC-FLIM）结合肽生物传感器，在活单细胞中监测乙酰转移酶的乙酰化活性。基于2D和3D培养体系，作者证明该肽传感器能够以荧光寿命依...
The G-quadruplex fluorescent probe 3,6-bis(1-methyl-2-vinyl-pyridinium) carbazole diiodide as a biosensor for human cancers.
本研究使用时间门控荧光寿命成像显微镜（time-gated FLIM）检测 3,6-双(1-甲基-2-乙烯基吡啶鎓)咔唑二碘化物（o-BMVC）在固定细胞中的荧光焦点。o-BMVC 与 G-四联体（G-quadruplex, G4）结合后呈现较长荧光衰减时间，因此以寿命阈值区分长寿命信号。结果显示，六种癌细胞系中 o-BMVC 焦点...
Cellulose-based scaffolds for fluorescence lifetime imaging-assisted tissue engineering.
定量测量pH和代谢物梯度是支架培养类器官和多细胞聚集体中的关键挑战。本文利用Cellulomonas fimi CenA蛋白的纤维素结合域（CBD）设计生物传感器支架，通过荧光强度与荧光寿命成像（FLIM）检测pH和Ca2+梯度。将CBD与pH敏感增强青色荧光蛋白ECFP融合，实现对纳米纤维素、细菌纤维素和脱细胞植物材料支架的高效标...
Accepting from the best donor; analysis of long-lifetime donor fluorescent protein pairings to optimise dynamic FLIM-based FRET experiments.
FRET 生物传感器是研究活细胞内特定信号通路激活的有用工具。多数现有传感器基于强度法 FRET 设计，而荧光寿命提供更可靠的 FRET 测量。近十年来，FLIM 系统更易获得，荧光蛋白种类也大幅增加，包括长寿命绿色/青色荧光蛋白 Clover 和 mTurquoise2、红色变体 mRuby2 以及暗受体 sREACh。本研究将这...
A RhoA-FRET Biosensor Mouse for Intravital Imaging in Normal Tissue Homeostasis and Disease Contexts.
小GTP酶RhoA参与正常组织中的多种基本过程，其时空调控被认为控制细胞的力学感知、生长和运动，而失调与疾病发生相关。本文报道了一种RhoA-荧光共振能量转移（FRET）生物传感器小鼠的构建及其在多种原生组织中实时监测RhoA活性的应用。作者利用该小鼠评估了骨内骨细胞力学感知和中性粒细胞迁移过程中RhoA活性的变化，并展示了小肠隐窝...
Multiplexing molecular tension sensors reveals piconewton force gradient across talin-1.
基于 Förster 共振能量转移（FRET）的张力传感器模块（TSMs）可用于研究细胞内不同蛋白如何承受机械力，但单皮牛顿（pN）级力仍难以分辨，且缺乏多路复用张力传感工具。本文报道了一种遗传编码的 FRET 生物传感器 FL-TSM 的构建与校准。该传感器具有近数字力响应，并在 3–5 pN 区间灵敏度提高。作者还提出一种方法，...
Real-Time Multiplex Kinase Phosphorylation Sensors in Living Cells.
磷酸化是参与细胞信号转导与调控的重要翻译后修饰，但现有研究蛋白激酶磷酸化的方法往往缺乏时空分辨率，且难以在活细胞中同时实时观察多种激酶的活性。本文提出一种肽生物传感器策略，并结合时间相关单光子计数-荧光寿命成像（TCSPC-FLIM），在活体二维和三维细胞培养模型中以单细胞分辨率实时探测 VEGFR-2 和 AKT 的磷酸化活性。作...
Intravital microscopy of biosensor activities and intrinsic metabolic states.
体内显微镜（IVM）是一种可在活体动物组织中实时检测亚细胞信号或代谢事件的成像工具。然而，在高散射生物组织中成像时，激发光与发射光随深度增加而衰减，深度依赖性信号衰减是 IVM 的主要限制，使定量测量变得困难。因此，IVM 定量分析需要采用内部校准探针，或采用不同于强度测量的信号评估方式。本文描述了如何利用基因编码生物传感器探针的比...
Transient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis.
不可切除胰腺癌患者的新兴标准治疗是吉西他滨与白蛋白紫杉醇（Abraxane）联合化疗，但患者反应仍有限。胰腺癌发生与转移发生在复杂微环境中，微环境线索与疾病进展和药物反应之间存在双向反馈。化疗前序贯双重靶向肿瘤组织张力与血管如何影响肿瘤反应尚不清楚。作者利用活体成像评估使用药物Rho激酶抑制剂法舒地尔（Fasudil）对肿瘤组织进行...
Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy.
本文介绍一种开源高内容分析（HCA）仪器，利用自动荧光寿命成像（FLIM）对多孔板中固定或活细胞进行Förster共振能量转移（FRET）读出，以检测蛋白相互作用、寡聚化、异二聚化及细胞信号过程。该系统基于宽场时间门控成像，采用门控光学图像增强器（GOI）、延迟发生器和冷却CCD相机，结合Nipkow旋转盘实现光学切片，可在每个视野...
Detecting intratumoral heterogeneity of EGFR activity by liposome-based in vivo transfection of a fluorescent biosensor.
尽管 EGFR 靶向抗癌药物已广泛进入临床，但总体生存获益有限，肿瘤内异质性被认为是治疗失败的重要机制。本研究应用荧光寿命显微镜（FLIM）生物传感技术，在活体肿瘤中检测 EGFR 活性异质性。作者使用遗传编码的 CrkII 基 FRET 生物传感器 Picchu-X，其 Y221 位点被 EGFR 磷酸化后发生构象变化，改变 eG...
De novo phosphorylation and conformational opening of the tyrosine kinase Lck act in concert to initiate T cell receptor signaling.
Src 家族酪氨酸激酶 p56Lck（Lck）的活性受 Tyr394 和 Tyr505 磷酸化调控。Tyr394 磷酸化和 Lck 构象开放被认为激活激酶，而 Tyr505 磷酸化形成关闭、失活构象。作者利用高灵敏度 FRET 生物传感器 TqLck-V2 和荧光寿命成像显微镜（FLIM），在未经刺激和 T 细胞受体（TCR）刺激后...
Investigation of the NADH/NAD
Ralstonia eutropha 是一种可氧化氢的细菌，能在异养与自养代谢之间切换，因而适用于生物氢生产、可降解聚合物和烃类等生物技术。其 H2 氧化在 O2 存在下由四种氢化酶介导，其中可溶氢化酶（SH）可逆地耦合 H2 氧化与 NAD+ 还原为 NADH，并已在体外和体内用于辅因子再生，因此 SH 与细胞 NADH/NAD+...
A FRET biosensor reveals spatiotemporal activation and functions of aurora kinase A in living cells.
AURKA过表达是上皮癌的重要标志。其编码多功能丝氨酸/苏氨酸激酶Aurora A，该激酶在中期被激活并参与细胞周期进程；在活细胞中评估其激活状态对下一代药物设计至关重要。本文报道一种Förster共振能量转移（FRET）生物传感器，用于检测Aurora A激酶在Thr288位点自磷酸化所诱导的构象变化。该传感器由EGFP供体、全长...
Imaging of Metabolic Status in 3D Cultures with an Improved AMPK FRET Biosensor for FLIM.
本文提出利用表达于肿瘤球体内的 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器，非侵入性绘制三维细胞培养中生化与生理变化的时空分布。重点报道改进的 AMP 活化蛋白激酶（AMPK）FRET 生物传感器 T2AMPKAR（mTurquoise2 AMPK Activity Reporter），用于荧光寿命成像（FLIM）读出，并在...