为在工业规模上生产高价值化学品，酿酒酵母的代谢工程需要广泛调控其代谢。本文鉴定了新的基因表达微调策略，以增强内源代谢通量，提高乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平。将基于dCas9的转录调控与响应丙二酰辅酶A的胞内生物传感器结合，用于筛选有益调控组合。候选基因由基因组尺度代谢模型预测，并设计了靶向168个基因的gRNA文库。经多轮荧光激活细...
在工程化大肠杆菌中构建的从头香草醛生物合成途径具有工业价值，但受儿茶酚 O-甲基转移酶（OMT）催化原儿茶酸转化为香草酸这一步骤限制。为寻找替代 OMT，作者基于鞘氨单胞菌 VanR-VanO 系统构建了香草酸遗传编码生物传感器。利用大肠杆菌启动子库进行理性优化后，最佳构建体获得大于 14 倍的动态范围。该传感器及其进化变体表现出显...
生物传感器可用于筛选或选择工程微生物中小分子的生产，但传感器自身发生突变会干扰准确信号转导，导致大量假阳性。已有策略通过将生产途径与生物传感器物理分离来避免该限制，但此前仅用于筛选而未用于选择。本文开发了一种基于共培养细菌竞争的新型生物传感器介导选择策略。以 cis,cis-粘康酸（cis,cis-muconate）生物合成为例，作...
无细胞系统是代谢工程和合成生物学中快速、高通量原型化生物部件的有前景平台。其主要限制之一是转录阻遏蛋白的抑制倍数较低，因此主要依赖阻遏蛋白的原核生物传感器开发受到限制。本研究展示如何在无细胞系统中优化此类生物传感器，包括采用含转录因子（TF）质粒的细胞制备 TF 掺杂裂解液、在加入报告 DNA 前对 TF 质粒进行预孵育，以及通过补...
多基因平衡表达是构建新生物合成途径或多蛋白细胞复合物的核心。本文报道一种名为 COMPASS（COMbinatorial Pathway ASSembly）的高通量克隆方法，用于在酿酒酵母中实现多基因平衡表达。该方法采用正交的植物来源人工转录因子（ATF）及其结合位点（BS），结合基于同源重组的体内/体外重叠克隆，可并行构建数千个 ...
蛋白工程在开发新代谢途径和优化现有途径中日益重要。传统基因/酶变体库筛选常在非生产菌株或非相关培养条件下进行，未必能选出最适合生产菌株体内使用的最佳酶变体。本文提出一种整合 CRISPR/Cas9 辅助目标基因工程与生长耦合、传感器引导体内筛选（CGSS）的方法，用于蛋白工程和代谢途径优化。作者以芳香氨基酸合成关键酶 3-脱氧-D-...
微生物可被工程化合成多种生物产品，但生产表型评价仍是设计-构建-测试循环中的常见瓶颈，菌株开发需要反复构建和测试文库。本文提出共生共培养放大生产表型（SnoCAP）方法。通过代谢交叉喂养回路，将目标分子产量转化为高度可区分的共培养生长特性，从而放大产量差异并转化为明显生长表型。作者以大肠杆菌为模型，分别筛选2-酮异戊酸（异丁醇前体）...
人乳寡糖（HMOs）是人乳中具有重要婴儿健康益处的复杂碳水化合物，但其生物合成优化受限于单糖和糖苷键检测通量低。传统色谱/质谱方法通量通常仅为每天数百样品且难以自动化。本文报道一种遗传编码细菌全细胞生物传感器，通过异源表达岩藻糖苷酶实现岩藻糖基化 HMO 结构 2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）和 3-岩藻糖基乳糖（3-FL）的高通量...
转录生物传感器可用于代谢途径的筛选、选择或动态调控，因此是加速代谢工程与可持续化学原型构建的关键使能技术。近期进展使异源转录因子得以常规使用，嵌合蛋白设计等新策略使工程师能够利用代谢物结合蛋白资源。然而，扩展生物传感器检测范围只是第一步，计算模型有助于微调传感器性能以实现定制化行为。此外，代谢工程将从无细胞表达系统进展中受益，既可用...
异丁醇是一种具有较高能量密度的 C4 支链高级醇，被视为下一代交通燃料。本研究建立了一种基于 BmoR 转录因子的生物传感器筛选系统，用于从大气和室温等离子体（ARTP）突变库中筛选异丁醇高产菌株。BmoR 是 Thauera butanivorans 正烷烃代谢中调控烷烃单加氧酶 σ54 依赖启动子 Pbmo 的醇响应转录因子，对...
丙酮酸羧化酶（PCx）是回补三羧酸循环的二氧化碳固定酶，在糖碳源生长过程中以草酰乙酸补充循环中间物。本研究利用赖氨酸生物传感器 pSenLys-Spc，在谷氨酸棒杆菌中筛选能够提高葡萄糖来源 L-赖氨酸产量的丙酮酸羧化酶变体。作者将经错误倾向 PCR 构建的 pyc 基因库转入合适的报告菌株，并通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选胞...
水杨酸可由常见代谢中间体莽草酸生物合成，并应用于制药和生物塑料工业。虽然针对莽草酸通路的代谢工程已实现多种芳香化合物合成，但通路组分相对表达水平如何影响水杨酸产量仍不清楚，且某些可提高产量的宿主基因缺失难以预测。本研究利用水杨酸响应型转录因子优化重组大肠杆菌中莽草酸/水杨酸通路基因的表达水平，并筛选染色体转座子插入库以提高水杨酸产量...
本文报道了一种用于检测胞内NADPH再生能力的NADPH营养缺陷型大肠杆菌全细胞生物传感器。作者构建了删除zwf、maeB、icd、pntAB和sthA的大肠杆菌NADPHaux菌株，仅保留6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（Gnd）作为内源NADPH产生途径。该菌株在M9最小培养基中只有加入葡萄糖酸作为NADPH来源时才能生长；若省略葡萄糖酸...
丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）是聚酮类、苯丙素类等高价值化合物合成的重要中心代谢物，但其胞内水平常受必需代谢竞争限制。现有malonyl-CoA生物传感器多依赖转录因子，仅在大肠杆菌和酿酒酵母中验证，且需多步信号转导。本文报道一种适用于大肠杆菌、铜绿假单胞菌和谷氨酸棒杆菌的比色malonyl-CoA生物传感器。作者将产生红色...
微生物合成烷烃被认为是可持续生产可直用燃料和化学品的有前景方法。二氧化碳是理想碳源，但单一生物体难以从二氧化碳高效合成长碳链烷烃。潜在方案是利用产乙酸菌将二氧化碳还原为乙酸，再工程化第二种菌将乙酸转化为长链烃。本研究展示由产乙酸菌 Acetobacterium woodii 和经工程改造的非原生产烷烃菌 Acinetobacter ...
启动子是DNA序列中响应转录因子并启动特定基因表达的小区域。启动子工程生物传感器可通过转录因子识别多胺、糖、内酰胺、氨基酸、有机酸或氧化还原分子，从而激活或抑制基因表达；但相关应用报道较少。本综述介绍了利用人和细菌遗传启动子阵列构建启动子-基因工程生物传感器的策略，并讨论其在高通量筛选（HTS）分子药物、膜蛋白定位与核质穿梭机制研究...
近年来，重组细胞中 D-葡萄糖酸（GA）生产取得进展，亟需高通量筛选和选择性能更优的重组细胞或生物催化剂。2016 年已开发一种在大肠杆菌中将 GA 浓度转化为荧光信号的生物传感器系统，但其应用报道较少。本文建立了一种不依赖微流控平台等专用装置的有效高通量筛选方法，并进行初步应用。在该一锅双菌株体系中，含有 GA 合成途径的产酸菌或...
三乙酰酸内酯（TAL，4-羟基-6-甲基-2-吡喃酮）可转化为多种高价值产品，具有通过代谢工程开发为可再生平台化学品的潜力。作者此前基于大肠杆菌 AraC 调控蛋白构建了内源 TAL 传感器，并用于筛选 2-吡喃合成酶（2-PS）变体文库，在大肠杆菌中鉴定出使液体培养 TAL 产量提高最多 20 倍的变体。本研究进一步优化该传感器-...
谷氨酸棒杆菌是工业生物技术中最重要的底盘菌之一。过去数十年，这种土壤细菌被用于大规模生产 L-谷氨酸和 L-赖氨酸，年产量达约 600 万吨。随着新型基因组编辑方法以及系统生物学和合成生物学工具的引入，谷氨酸棒杆菌的产品谱已从传统食品和饲料产品扩展到化学工业、化妆品和医疗健康领域。近五年来，其工业产品数量几乎翻倍，达到约 70 种天...
微生物利用生物质生产高附加值化学品是化学合成的可持续替代途径。为提高产物滴度、产率和选择性，需优化工程菌中的代谢通路。动态通路调控可在发酵过程中调节通路相关酶的表达，从而将内源通量导向产物合成、平衡关键中间体的生成与消耗，并抑制毒性中间体早期积累。本文在大肠杆菌中叠加两种正交、自主且可调的动态调控策略，以独立调节两种不同酶的表达，提...