香芹醇（perillyl alcohol）是一种具有抗癌潜力的天然单萜，但其生物合成量有限。细胞色素P450单加氧酶CYP153A6在大肠杆菌中催化柠檬烯羟基化生成香芹醇，是该途径的限速步骤，此前尚未通过定向进化改进。本文报道了一种基于假单胞菌Pseudomonas putida F1中CymR阻遏蛋白的遗传编码生物传感器，使其能够...
萜类化合物是重要的天然产物，但许多高价值萜类化合物的微生物合成受限于生物合成途径理性工程困难以及缺乏直接报告产物形成的高通量筛选系统。α-松油醇等单萜醇在异源宿主中的合成需要前体生成、环化和水捕获化学的协同。本文通过结构指导定向进化改造对香芹酚阻遏蛋白 CymR，开发了可检测 α-松油醇的转录因子型全细胞生物传感器菌株。基于推测配体...
理想的转录调控回路应在无诱导剂时保持沉默，并在加入效应物后具有宽诱导动态范围。大肠杆菌 lac 操纵子启动子 Plac 因 LacI 对操纵子亲和力中等而存在泄漏表达。本研究通过定向进化改造 LacI 调控蛋白，获得携带 I79T 和 N246S 突变的 M7 突变体。与野生型 LacI 相比，M7 使 lac 启动子泄漏表达降低约...
基于变构转录因子的生物传感器在合成生物学中应用广泛。本研究利用不动杆菌ADP1中的转录因子PobR构建生物传感器，其天然配体4-羟基苯甲酸（4HB）结合后激活PpobA启动子。为筛选响应4-羟基苯基丙酮酸（HPP）的PobR突变体，作者在E. coli中建立双选择系统：正选择用于富集能识别目标配体的突变体，负选择用于消除或削弱仍响应...
快速筛选策略对于从多样化酶库中鉴定所需变体、定制用于D-阿洛酮糖合成的生物催化剂至关重要，但目前酮糖3-差向异构酶（KEases）催化性能不足限制了其应用。本研究基于重新设计的D-阿洛酮糖依赖型生物传感器系统，构建了一种设备依赖少、高通量、生长耦合的体内筛选平台。通过系统优化调控PsiR表达水平的遗传元件，提高了生物传感器的生长响应...
酶稳定性常限制微生物生产高附加值化学品和商用酶。作者前期发现，来自 Ipomoea batatas 的异戊二烯合酶 IspSib 热稳定性差，严重限制工程大肠杆菌中异戊二烯生产。本研究通过定向进化提高 IspSib 热稳定性。首先构建三组分蛋白折叠系统 lac′-IspSib-′lac，将 IspSib 的折叠稳定性与氨苄青霉素抗性...
重编程细胞行为是合成生物学的重要目标。原核变构转录因子（aTF）可被改造为将小分子信号转化为细胞响应的通用工具，因此扩展其识别新诱导剂的能力具有重要意义。本文首先在大肠杆菌中利用谷氨酸棒杆菌 TetR 家族阻遏蛋白 RolR 建立了间苯二酚响应的 aTF 生物传感器。随后，作者沿 RolR 的适应度景观进行迭代定向进化，获得可识别儿...
甲醇是可由二氧化碳和天然气可持续生产的一碳生物制造原料，但其生物转化效率受 NAD+ 依赖型甲醇脱氢酶（Mdh）催化甲醇氧化为甲醛的催化性能限制。本研究对来自 Bacillus stearothermophilus DSM 2334 的中性嗜温 NAD+ 依赖型 Mdh（MdhBs）进行定向进化，以提高其催化活性。作者构建了基于甲醛...
近期生物传感器研究有望实现大基因文库高通量筛选，但生理限制和机制知识不足会阻碍微生物系统高滴度，也影响生物传感器应用。本文表征了先前开发的基于转录因子 ExuR 的半乳糖醛酸生物传感器对其另一配体葡萄糖醛酸的响应。在受控理想条件下，该传感器对葡萄糖醛酸表现出理想响应；但在将其应用于不同 myo-肌醇加氧酶（MIOX）同源物时，响应出...
高通量细胞分选是合成生物学、临床研究和药物发现等领域的重要技术。流式细胞术虽可实现超高通量分选，但主要依赖细胞大小和表面标记，难以分析单细胞分泌产物。液滴微流控分选可为单细胞提供独立微环境，但针对多种分析物建立高通量分选方法仍具挑战。本研究开发基于葡萄糖胺（GlcN）检测的高通量液滴分选系统，用于定向进化二乙酰壳二糖脱乙酰酶（Dac...
D-阿洛酮糖是D-果糖C-3位差向异构体，甜度与蔗糖相近，作为低热量甜味剂在食品和医药领域具有广阔应用前景。目前D-阿洛酮糖主要依靠D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DAEase）催化D-果糖转化生产，但DAEase比活性和热稳定性有限，制约工业应用。本研究从培养基成分、筛选质粒和表达宿主等方面系统优化基于转录因子PsiR的超高通量筛选检...
细菌生物传感器因灵敏、特异、低成本和易操作而在污染物检测中具有重要潜力，但现有镉响应细菌生物传感器在灵敏度、特异性和抗干扰能力方面难以满足实际检测需求。本研究旨在开发一种用于检测实际环境样品中总镉和可提取镉的细菌生物传感器。作者将镉响应转录调控元件 CadR 与绿色荧光蛋白报告元件 GFP 构建到表达载体中，形成镉诱导型全细胞生物传...
4-羟基扁桃酸（HMA）广泛用于医药、食品和化妆品。本研究旨在开发基于变构转录因子（aTF）的 HMA 生物传感器。以 HMA 类似物 4-羟基苯甲酸（4HB）响应型 aTF PobR 为模板，通过定向进化改变其配体选择性，获得可响应 HMA 的新型 aTF。利用易错 PCR 和 Megawhop PCR 构建容量约 55 万突变的...
体内生物传感器可用于代谢物检测和代谢网络调控，是合成生物学与代谢工程的重要工具，但现有传感器数量和性能仍不足。本研究以枯草芽孢杆菌甘氨酸核糖开关为基础，构建甘氨酸核糖开关文库，并结合荧光激活细胞分选（FACS）和 tetA 双遗传选择，在大肠杆菌中筛选出合成甘氨酸-OFF 核糖开关 glyOFF6 和检测范围扩大的合成甘氨酸-ON ...
基于转录因子（TF）的生物传感器有望成为高通量筛选生物催化系统的重要工具，但多数天然 TF 仅在狭窄配体浓度范围内响应，限制了应用。本研究利用枯草芽孢杆菌抑制型转录因子 BsNadR 及其靶启动子，在大肠杆菌中构建了异源烟酸生物传感器。通过易错 PCR（EP-PCR）介导的脱敏工程，将 BsNadR 对烟酸和 DNA 的结合亲和力降...
埋地雷探测风险高且耗资大，微生物生物报告菌可在接触炸药蒸气后发出光学信号，为远程探测提供替代方案。作者此前构建了基于大肠杆菌的 2,4,6-三硝基甲苯（TNT）及其杂质 2,4-二硝基甲苯（DNT）生物报告菌。本研究通过定向进化 yqjF 启动子的转录激活因子 YhaJ，进一步优化该生物报告菌。经三轮易错 PCR 随机突变与筛选，获...
对映体纯 D-氨基酸是肽模拟物和半合成抗生素中重要的手性构建块。本研究采用基于转录因子的筛选策略，利用酶特异性氨基酚人工底物快速筛选 D-立体特异性氨基酸酰胺酶。作者以 D-苏氨酸苯基酰胺衍生物 DTHPA 为底物，在 D-苏氨酸酰胺酶存在下水解生成 2-氨基苯酚，后者作为潜在酶指示物激活遗传电路。对已知细菌的比较分析显示，若干芽孢...
原核转录因子可被重新用作精确化学测量与调控的分析及合成工具。单萜是一类在食品、化妆品、香料和医药领域具有重要商业价值的化合物，但因其缺乏发色团且同分异构体难以区分，尤其难以在细胞内快速定量。本文以假单胞菌 Pseudomonas putida 中响应樟脑的 TetR 家族转录调控因子 CamR 为平台，通过定向进化扩展其效应物特异性...
基于转录因子（TF）的生物传感器是高通量酶与菌株工程中的理想工具，但被检测小分子可能从高产量细胞泄漏至低产量细胞并激活其传感器，造成串扰，使假阳性/“作弊”细胞在富集群体中过度代表。虽然可通过改造宿主（如删除转运体）减少串扰，但对被动扩散分子并不普适。作者以反式肉桂酸（tCA）生物传感器为例，发现其在苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）定向进...
短链醇的生物合成是替代石油基燃料的碳中性途径，但大规模菌株筛选长期受限于气相色谱、液相色谱等繁琐分析。本文以假单胞菌 Pseudomonas putida GPo1 的转录因子 AlkS 及其同源启动子 PalkB 为基础，通过错误 PCR 随机突变、流式分选富集和位点饱和突变等定向进化策略，构建并表征了可识别正丁醇、异戊醇、异丁醇...