Design and optimization of a kinase-controlled allosteric switch.
翻译后修饰可实现细胞行为的快速精确调控，但构建磷酸化合成通路的通用策略有限。作者提出利用工程别构原理设计磷酸化控制蛋白开关（phospho-switch）。以别构可控的 Gal4 转录因子为支架，将经典激酶 FRET 生物传感器 EKAR 的感知域插入 Gal4 DNA 结合域 SK22 位点，使 ERK 磷酸化事件通过 Pin1 ...
Deciphering the history of ERK activity from fixed-cell immunofluorescence measurements.
RAS/ERK 通路在多种癌症的诊断与治疗中起核心作用，ERK 活性在单细胞内高度动态，并通过 c-Myc、c-Fos、Fra-1 和 Egr-1 等效应蛋白驱动增殖、代谢等过程。本文利用活细胞 FRET 生物传感器 EKAR3.1 测量 ERK 活性，并与下游靶蛋白的循环免疫荧光（4i）多重染色联用，构建单细胞活细胞信号与固定细胞...
Generation of pulsatile ERK activity in mouse embryonic stem cells is regulated by Raf activity.
细胞外调节激酶（ERK）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与细胞增殖、分化等过程，其 Ras-Raf-MEK-ERK 通路对小鼠着床前胚胎原始内胚层分化及胚胎干细胞（ESC）体外分化至关重要。为在活细胞水平监测未分化和分化 ESC 中的 ERK 活性，作者利用 PiggyBac 系统建立稳定表达 FRET 生物传感器 EKAREV-NLS...
Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism.
FRET 可在原位探测分子结合，但多个 FRET 对同时测量常受供体与受体荧光团光谱带宽限制。本文提出利用供体荧光团的光致变色区分光谱重叠的 FRET 对，即使相关荧光团的吸收和发射光谱几乎相同。作者建立了该方法的理论框架，并通过数值模拟验证其可行性。为应用该系统，作者开发了用于 cAMP 依赖性蛋白激酶 A（PKA）的光致变色生物...
Mining single-cell time-series datasets with Time Course Inspector.
得益于生物传感器活细胞成像的最新进展，显微实验可产生数千条单细胞时间序列。为识别具有不同时间行为、对应不同细胞命运的亚群，我们开发了时间课程检查器（Time Course Inspector, TCI）——一个用 R/Shiny 编写的独特工具，将时间序列分析与聚类相结合。借助 TCI，用户可以方便地检查时间序列、绘制不同数据视图并...
Visualizing cellular heterogeneity by quantifying the dynamics of MAPK activity in live mammalian cells with synthetic fluorescent biosensors.
有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通过将胞外信息转导为特定生物学反应，调控细胞生长、分化、应激适应和凋亡等多种功能。为理解这些通路的调控机制，需要在活体单细胞水平进行动态定量测量。荧光显微成像适合此类测量，但仍需更灵敏、动态范围更大的生物传感器。作者将酵母中合成的激酶活性转位传感器（SKARS）改造用于哺乳动物细胞，构建了可被人源...
ERK mediated survival signaling is dependent on the Gq-G-protein coupled receptor type and subcellular localization in adult cardiac myocytes.
通过 Gαq 信号的经典 G 蛋白偶联受体（GqPCR），如 α1-肾上腺素能受体和血管紧张素受体（α1-AR、AT-R），传统上被认为介导心力衰竭中的病理性重构，包括心肌细胞死亡。然而，作者此前发现 α1-AR 具有心脏保护作用，并鉴定出成年心肌细胞中 α1A 亚型-ERK 存活信号通路。近期研究还显示，α1-AR 定位于细胞核并...
ERK Activity Dynamics during Zebrafish Embryonic Development.
在脊椎动物发育过程中，细胞外信号调节激酶（ERK）可被成纤维细胞生长因子（FGF）等生长因子激活，并参与眼、脑、体节、肢体和内耳等组织器官的形成。然而，目前缺乏能够在整个脊椎动物胚胎体内实时监测 ERK 活性动态的实验系统。本研究构建了稳定且泛表达 FRET 型 ERK 生物传感器的转基因斑马鱼品系 Tg[ef1α:ERK bios...
Live-Cell FRET Imaging Reveals a Role of Extracellular Signal-Regulated Kinase Activity Dynamics in Thymocyte Motility.
细胞外调节激酶（ERK）在胸腺 T 细胞发育中发挥关键作用，但 ERK 活性动态及其对胸腺细胞运动性的调控仍因技术限制而不清楚。为在胸腺细胞中实时可视化 ERK 活性，作者构建了从 ROSA26 位点表达基于 Förster/荧光共振能量转移（FRET）的 ERK 生物传感器 EKAREV 的敲入报告小鼠。对报告小鼠来源胸腺细胞的活...
Dynamic MAPK/ERK Activity Sustains Nephron Progenitors through Niche Regulation and Primes Precursors for Differentiation.
肾单位祖细胞（nephron progenitors, NPs）的体内微环境及其基本细胞特性仍不清楚。本研究利用表达 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器的转基因小鼠，对胚胎肾中 ERK 活性进行活体成像，发现 NPs 中 MAPK/ERK 通路呈动态激活模式，而正在分化的肾单位前体细胞则表现为持续性激活。遗传学实验表...
A Novel Morphological Marker for the Analysis of Molecular Activities at the Single-cell Level.
组织学长期依赖苏木精-伊红（H&E）染色，但活体多光子成像尚未充分利用，因为缺乏合适的形态标记。本文报道一种遗传编码荧光形态标记 NuCyM（Nucleus, Cytosol, and Membrane），旨在活体内重现 H&E 染色模式。作者利用 ROSA26 细菌人工染色体（BAC）构建普遍表达 NuCyM 的转基因小鼠。NuC...
Activation of Erk in ileal epithelial cells engaged in ischemic-injury repair.
肠上皮细胞构成保护机体免受病原体和膳食物质侵害的物理屏障，因此其损伤必须迅速修复。多项体内和体外研究表明细胞外信号调节激酶（Erk）参与再生过程，但 Erk 活性与组织形态相关的空间调控尚未充分阐明。本研究利用双光子显微镜和携带 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器的小鼠，在活体小鼠回肠上皮细胞中实时监测 Erk 活性...
A Real-Time Biosensor for ERK Activity Reveals Signaling Dynamics during C. elegans Cell Fate Specification.
激酶转位报告蛋白（KTR）是一类遗传编码的荧光活性传感器，可将激酶活性转化为核质穿梭平衡，用于观察单细胞信号动态。本研究将第一代细胞外信号调节激酶（ERK）KTR改造为便于在秀丽隐杆线虫体内使用的ERK-nKTR。该传感器通过分析单个细胞核即可对ERK活性进行定性和定量评估，并能在多种细胞背景下忠实报告发育和神经功能中的ERK活性。...
Intravital Förster resonance energy transfer imaging reveals osteopontin-mediated polymorphonuclear leukocyte activation by tumor cell emboli.
髓系来源抑制细胞（MDSC）可引起副肿瘤性类白血病反应并促进肿瘤转移，但MDSC与肿瘤细胞在活体组织中的相互作用尚未被充分可视化。为此，作者建立了用于观察小鼠肺内转移肿瘤细胞的活体成像方案。为可视化MDSC激活，将表达ERK FRET生物传感器的转基因小鼠骨髓细胞移植入宿主小鼠。在双光子激发显微镜下，发现足垫接种4T1乳腺癌细胞的小...
Cell Density-Dependent Increase in Tyrosine-Monophosphorylated ERK2 in MDCK Cells Expressing Active Ras or Raf.
细胞外调节激酶（ERK）是传递 Ras 和 BRaf 等癌基因生长信号至下游效应蛋白的枢纽蛋白。然而，表达活性 Ras 和 BRaf 的癌组织中 ERK 活性是否升高存在矛盾。我们推测细胞密度可能是原因。为此，构建了表达活性 HRas、NRas、KRas 或 BRaf，并携带基于 Förster 共振能量转移（FRET）原理的 ER...
Frequency modulation of ERK activation dynamics rewires cell fate.
在 PC-12 细胞中，表皮生长因子（EGF）或神经生长因子（NGF）诱导的 ERK MAP 激酶（MAPK）激活动力学呈瞬时或持续模式，分别驱动增殖或分化，因此 ERK 激活持续时间被认为决定细胞命运。作者利用 FRET 生物传感器 EKAR2G 在单活细胞中测量 ERK 激活动力学，发现持续施加 EGF 或 NGF 时，群体中不...
Heterogeneity in ERK activity as visualized by in vivo FRET imaging of mammary tumor cells developed in MMTV-Neu mice.
人表皮生长因子受体2/Neu（HER2/Neu）在约30%的乳腺癌中过表达，主要通过Ras–Raf–MEK–ERK通路传递生长信号，但乳腺癌组织中ERK活性高低与预后关系仍有争议。为阐明ERK活性在乳腺癌进展中的作用，作者将MMTV-Neu转基因小鼠与表达ERK荧光共振能量转移（FRET）生物传感器EKAREV的转基因小鼠杂交，利用...
Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements.
在生物传感器中，遗传编码的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器被广泛用于在活细胞或组织中定位并测量酶活性。激酶活性尤其重要，因为其时空调控对理解细胞命运决定至关重要；ERK 是信号转导通路中的关键节点，可引导细胞进入不同生理过程。为在体内分析激酶并检测其活性的细微变化，需要更好的工具。本文报道了对先前 ERK 活性报告分子 EKA...
Stochastic ERK activation induced by noise and cell-to-cell propagation regulates cell density-dependent proliferation.
细胞外调节激酶ERK在细胞生长信号级联中起核心作用。本文利用基于荧光共振能量转移（FRET）的ERK生物传感器EKAREV，在活细胞中长时间监测ERK活性，发现ERK活性以随机脉冲形式自发出现，并可在邻近细胞间传播。在正常大鼠肾上皮细胞NRK-52E中，ERK脉冲频率随细胞密度呈钟形变化，在中等密度时最高，而脉冲幅度基本不变；脉冲频...
REV, A BRET-Based Sensor of ERK Activity.
细胞信号网络在环境刺激下被激活，其特异性取决于下游通路在时间和空间上的动态整合。为解析单一信号通路的动态调控，研究者开发了多种活细胞生物传感器。生物发光共振能量转移（BRET）技术因无需荧光激发、信噪比高，特别适合监测活细胞中的蛋白互作或构象变化。细胞外调节激酶（ERK）广泛表达并参与增殖、分化、神经可塑性、存活和凋亡等多种功能，其...