硝酸盐（NO3−）和亚硝酸盐（NO2−）是一氧化氮（NO）的生理来源，对 NO 稳态及心血管功能具有有益作用。为在活细胞中可视化 NO3−/NO2− 的动态变化，作者利用根瘤菌反硝化系统中 NO3−/NO2− 诱导的 NasST 复合物解离，构建了一种遗传编码的分子间荧光共振能量转移（FRET）指示剂 sNOOOpy。该指示剂由 C...
Polo-like kinase 1（Plk1）是细胞进入分裂期及完成有丝分裂所必需的激酶，但其在G2/M期精确调控Cdc25C磷酸酶（Cyclin B1-Cdk1激活剂）的分子事件和时空机制仍不清楚。为实时解析Cdc25C在细胞周期中的磷酸化动态，作者构建了遗传编码的FRET（Förster共振能量转移）磷酸化生物传感器。该传感器...
在 PC-12 细胞中，表皮生长因子（EGF）或神经生长因子（NGF）诱导的 ERK MAP 激酶（MAPK）激活动力学呈瞬时或持续模式，分别驱动增殖或分化，因此 ERK 激活持续时间被认为决定细胞命运。作者利用 FRET 生物传感器 EKAR2G 在单活细胞中测量 ERK 激活动力学，发现持续施加 EGF 或 NGF 时，群体中不...
实时监测活细胞内激酶活性动态有助于理解信号转导的时空调控。本文报道了双分子激酶活性报告器（bimKARs）作为分子工具在增强激酶活性实时可视化方面的适应性。作者证明 bimKAR 设计具有高度通用性，可用于监测多种激酶，包括 JNK、ERK 和 AMPK。与单分子报告器相比，bimKAR 可具有显著增大的动态范围，从而揭示此前难以检...
无机磷酸盐（Pi）在代谢、细胞信号和能量转换中具有核心作用，动物体内 Pi 的分配必须与膳食供给及不同细胞代谢需求紧密协调。为全面理解 Pi 转运与回收机制，需要具有空间和时间分辨率的 Pi 动态监测方法。本文展示了一种遗传编码的 FRET 型 Pi 传感器在秀丽隐杆线虫中的应用。该传感器在不同细胞和组织中表达，包括头部神经元、尾部...
动脉粥样硬化发展与内膜细胞形态变化相关，可导致血管平滑肌细胞（VSMCs）出现星状细胞表型。本研究旨在确定动脉粥样硬化斑块中关键促动脉粥样硬化细胞因子（IL-1β、TNFα 和 IFNγ）是否能诱导该表型，因为这些分子已知可触发 VSMCs 转分化。结果显示，在所测试的主要炎症介质中，只有 IL-1β 能在 VSMCs 中诱导星状形...
多光子显微镜系统的商业化推动了活体显微镜在完整动物细胞生物学研究中的应用，而基于荧光蛋白（FP）的生物传感器可实时监测多种细胞过程。Förster 共振能量转移（FRET）探针是检测细胞事件最灵敏的指标之一，但双光子激发（2PE）与单光子激发的差异使活体 2PE FRET 测量仍具挑战。本文提出一种简化 FRET 生物传感器用于活体...
基于 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器可用于在活细胞中可视化信号分子的时空动态。许多分子内 FRET 传感器以青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）分别作为供体和受体。然而，由于 YFP 与 CFP 基因之间重组率高，利用慢病毒或逆转录病毒基因转移建立稳定表达 YFP/CFP FRET 传感器的细胞系仍较...
内皮细胞间连接维持限制性屏障，并受促血管生成因子、炎症介质和黏附白细胞等刺激动态调控。这些刺激引起黏附连接暂时重塑，依赖 Rho-GTPase 控制的细胞骨架重排，但鸟苷酸交换因子（GEF）如何在内皮黏附连接处时空调控 Rho-GTPase 活性仍不清楚。本文鉴定 Rho-GEF Trio 在稳定基于血管内皮（VE）-钙黏蛋白（VE...
Polo-like kinase 1（Plk1）是控制有丝分裂和细胞分裂的关键激酶。Plk1 在 S 期首先被招募到中心体，在 G2 晚期出现在动粒上，并在有丝分裂末期转位至中央纺锤体。Plk1 的激活需要 Aurora A 对其 T210 位点进行磷酸化，该过程依赖共因子 Bora。然而，关于 Plk1 最初在何处被激活存在争议：...
基于荧光蛋白突变体之间 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器已广泛用于生理学与生物化学研究，但许多 FRET 传感器在亚最优实验条件下 FRET 变化较小，测量困难。当前领域的重要任务之一是开发新的优化策略。本文报道了通过细菌菌落大规模筛选突变体 FRET 传感器文库来优化 FRET 变化的方法。作者优化了传感器表达...
黏着斑连接细胞外基质与肌动蛋白骨架，介导细胞黏附、迁移、机械感知和信号转导。黏着斑具有保守的纳米尺度蛋白组织，提示蛋白在黏着斑中的位置调控其活性与功能。vinculin 结合不同黏着斑蛋白以介导不同细胞功能，但其相互作用在黏着斑内如何时空组织尚不清楚。作者利用干涉光激活定位超分辨显微镜检测 vinculin 纳米定位，并利用 FRE...
初级纤毛是多数哺乳动物细胞表面的非运动性天线状结构，在软骨、骨和肾等组织的化学与机械感知中起关键作用。肾上皮中流致细胞内钙离子升高依赖初级纤毛及纤毛定位的钙通透通道多囊蛋白-2（PC2）和瞬时受体电位香草酸4（TRPV4），但骨细胞机械转导的分子机制尚不清楚。作者将基于荧光共振能量转移（FRET）的钙离子生物传感器与初级纤毛特异性蛋...
荧光共振能量转移（FRET）型传感器通过配体结合改变两个荧光蛋白之间的距离和取向，将识别事件转换为荧光光谱变化。本研究报道，将分析温度提高到通常高于50°C的临界温度，可显著提高以细菌周质结合蛋白（PBP）为识别元件的FRET糖类传感器信号强度。其机制是临界温度下背景信号突然降低，而在存在配体时最大FRET比率得以恢复。以麦芽糖结合...
本研究开发了一种基于细胞基底形变的机械刺激装置和一种更灵敏的细胞黏附测量方法。精确定位于细胞附近的探针可实现垂直局部机械刺激，频率约207 Hz，应变幅度约50%。该装置用于检测人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的钙信号响应。细胞内钙离子浓度通过基因编码的Cameleon生物传感器测量，同时抑制瞬时受体电位阳离子通道M亚家族成员7（T...
α7 烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nAChR）激活可改善海马依赖学习记忆，但机制不清。我们此前报道其激活以 PKA 依赖方式增强谷氨酸能突触传递。本研究用 FRET 生物传感器通过活细胞成像直接测量海马神经元胞内 cAMP。结果显示，在 α7 nAChR 正性变构调节剂 PNU-120596 存在下，α7 选择性激动剂胆碱使 F535...
重复核苷酸或氨基酸序列常被工程化到探针和生物传感器中，以实现功能读出和稳健信号放大，但这些重复序列极易发生异常缺失和降解，影响生物功能的正确检测与解释。本文提出一种简便且可推广的方法，通过修饰靶 mRNA 的核苷酸序列，使其成为非重复但仍具功能的“同义”序列。作者首先设计一组同义 MS2 RNA 基序和串联衣壳蛋白用于 RNA 成像...
通常认为，遗传编码报告蛋白中常用的青色和黄色荧光蛋白在接近生理pH范围内具有强pH敏感性。我们研究了这些pH响应对在活BHK细胞胞质中表达的模型FRET串联体和基于FRET的cAMP依赖性蛋白激酶活性报告蛋白（AKAR）胞内信号的影响，并通过尼日里菌素离子载体改变胞内pH。尽管供体和受体的同时pH敏感性在某些情况下可能相互掩盖，但与...
基因编码的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器已被成功用于在活细胞中可视化蛋白质活性。FRET 测量的敏感性和准确性直接取决于生物传感器的折叠效率、表达模式、灵敏度和动态范围。为提高 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IIα（CaMKIIα）FRET 传感器的折叠效率，作者利用易错聚合酶链式反应（PCR）扩增 CaMKIIα 基因...
转基因小鼠在现代生物医学研究中具有重要作用，不仅可用于解析特定基因和蛋白功能，还可作为表达荧光生物传感器的工具，在活细胞中实时报告第二信使水平和生化过程。本章提供构建质粒载体并生成表达FRET生物传感器的转基因小鼠的详细方案。该传感器为基于Förster共振能量转移（FRET）的cAMP生物传感器Epac1-camps，由cAMP结...