Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors.
转基因小鼠在现代生物医学研究中具有重要作用，不仅可用于解析特定基因和蛋白功能，还可作为表达荧光生物传感器的工具，在活细胞中实时报告第二信使水平和生化过程。本章提供构建质粒载体并生成表达FRET生物传感器的转基因小鼠的详细方案。该传感器为基于Förster共振能量转移（FRET）的cAMP生物传感器Epac1-camps，由cAMP结...
ROZA-XL, an improved FRET based biosensor with an increased dynamic range for visualizing zeta associated protein 70 kD (ZAP-70) tyrosine kinase activity in live T cells.
基因编码的FRET生物传感器可在活细胞中实时观察特定酶活性的空间与时间变化。作者此前报道了特异性识别Zeta相关蛋白70 kD（ZAP-70）的FRET生物传感器；ZAP-70是Syk家族蛋白酪氨酸激酶，对早期T细胞受体（TCR）信号、T淋巴细胞发育以及整合素介导的T细胞迁移至关重要。为便于研究免疫突触形成或细胞迁移等动态过程中的Z...
Application of a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensor for detection of drug-induced apoptosis in a 3D breast tumor model.
二维培养常用于药物测试，但难以反映肿瘤内部细胞的空间相互作用；三维培养可模拟实体瘤结构，却难以长期评估药物效应，因此需要实时、纵向分析平台。本研究将编码荧光共振能量转移（FRET）生物传感器的质粒 DNA 转染人乳腺癌细胞，建立 MCF7-C3 和 MDA-MB-231-C3 细胞系，用于检测 caspase-3 激活。健康细胞呈绿...
DENND2B activates Rab13 at the leading edge of migrating cells and promotes metastatic behavior.
小 GTP 酶 Rab13 参与上皮细胞外泌体囊泡运输，其活性改变与人类癌症相关，但激活机制及在肿瘤进展中的作用不清。本研究鉴定 DENN 结构域蛋白 DENND2B 为 Rab13 的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），并开发一种基于 Förster 共振能量转移（FRET）的新型 Rab13 生物传感器，用于在活细胞中实时监测 Ra...
Dendritic geometry shapes neuronal cAMP signalling to the nucleus.
神经元具有复杂树突树，在不同距离接收大量输入，但分子信号从树突向细胞核传播的规则尚不清楚。DARPP-32 是纹状体输出神经元中受磷酸化调控的信号枢纽。作者结合扩散-反应建模与活细胞成像，研究 cAMP 激活的 DARPP-32 信号如何到达细胞核。模型预测，由于树突直径沿分支逐级减小，在次级树突中产生 cAMP 对细胞核的影响最大...
Laser-induced shockwave paired with FRET: a method to study cell signaling.
体内细胞会受到多种力学刺激，但细胞响应机械刺激的细节仍不清楚。本文证明，将激光诱导冲击波（LIS）与基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器相结合，是研究单活细胞生物过程的一种有前景的新方法。作为概念验证，作者利用FRET钙生物传感器D3CPV，在激光诱导冲击波作用下观察到牛动脉内皮细胞释放胞内钙。在所用激光参数下，细胞保持原有...
Higd1a is a positive regulator of cytochrome c oxidase.
细胞色素c氧化酶（CcO）是线粒体氧化磷酸化中唯一利用氧气建立质子梯度的酶。尽管低氧可增强CcO活性，其调控机制长期不明。作者在大鼠新生心肌细胞中筛选低氧诱导基因，发现低氧诱导结构域家族成员1A（Higd1a）是CcO的正调控因子。重组Higd1a可直接整合入高纯度牛心CcO复合物，并将其活性提高约2倍。共振拉曼光谱显示，Higd1...
cAMP assay for GPCR ligand characterization: application of BacMam expression system.
环磷酸腺苷（cAMP）是多种G蛋白偶联受体（GPCR）的第二信使，细胞内cAMP水平变化常被用于评估GPCR特异性配体的生物活性。FRET生物传感器已用于cAMP检测，其比率敏化发射（SE）检测可在荧光微孔板读仪上实施，但需要细胞表达足够且可重复的传感器蛋白。本章介绍利用BacMam杆状病毒转导系统实现cAMP FRET生物传感器（...
Heterogeneity in ERK activity as visualized by in vivo FRET imaging of mammary tumor cells developed in MMTV-Neu mice.
人表皮生长因子受体2/Neu（HER2/Neu）在约30%的乳腺癌中过表达，主要通过Ras–Raf–MEK–ERK通路传递生长信号，但乳腺癌组织中ERK活性高低与预后关系仍有争议。为阐明ERK活性在乳腺癌进展中的作用，作者将MMTV-Neu转基因小鼠与表达ERK荧光共振能量转移（FRET）生物传感器EKAREV的转基因小鼠杂交，利用...