Biosensor-Based Directed Evolution of Methanol Dehydrogenase from
甲醇脱氢酶（Mdh）是利用甲烷和甲醇作为碳源与能源的关键酶，在甲基营养和合成甲基营养中具有重要作用。NAD 依赖型 Mdh 因单亚基、可在有氧和厌氧条件下产生 NADH 而成为合成甲基营养工程的重要候选，但其催化活性低、对甲醇亲和力不足限制了应用。本研究采用基于转录因子的生物传感器，对来自 Lysinibacillus xylani...
Recombinant Antibody Engineering Enables Reversible Binding for Continuous Protein Biosensing.
工程抗体以提高靶标特异性、降低检测限或引入新功能，是生物传感器开发的重要方向。尽管已有多种亲和生物传感器可在不同分析物浓度下产生输出信号，但在复杂生物样品中实现可逆、连续的蛋白监测仍具挑战。本文探索利用定向进化调节高亲和抗表皮生长因子受体（EGFR）单链可变抗体片段（scFv）的解离动力学，从而在无标记结合检测中实现连续蛋白传感。研...
Engineering sensitivity and specificity of AraC-based biosensors responsive to triacetic acid lactone and orsellinic acid.
我们此前报道了基于 AraC 调控蛋白的三乙酸内酯（TAL）生物传感器 AraC-TAL1。该变体虽可用于筛选增强 TAL 生物合成的酶库，但存在背景泄漏表达较高、TAL 敏感性较差以及诱导剂特异性宽松等问题，尤其对奥赛利酸（OA）也有响应。开发对 TAL 或 OA 更具特异性的敏感生物传感器，有助于研究和工程化合成这些类似聚酮化合...
Genetically Encoded Biosensor-Based Screening for Directed Bacteriophage T4 Lysozyme Evolution.
溶菌酶是研究蛋白质结构与功能关系的经典模型蛋白，近期也被用于加速以细菌为主的二级污泥降解，但针对溶菌酶工程化的高通量筛选系统尚未见报道。本文建立了一种基于遗传编码生物传感器的T4溶菌酶（T4L）筛选系统。作者将T4L基因克隆至araBAD启动子（PBAD）控制的质粒中，并在大肠杆菌DH5α中实现可溶性表达，且未对细胞生长产生毒性。进...
Increasing thermal stability and improving biodistribution of VEGFR2-binding affibody molecules by a combination of in silico and directed evolution approaches.
血管内皮生长因子（VEGF）配体家族及其与VEGF受体（VEGFRs）的相互作用在病理性与生理性血管生成中均发挥重要作用。因此，靶向该信号通路的激动剂和拮抗剂配体在基础生物学研究以及治疗和诊断开发中具有潜力。本研究通过计算机模拟与定向进化相结合的方法，工程化改造结合VEGFR2的Affibody分子，以提高其热稳定性、复性能力和体内...
Engineered glyphosate oxidase coupled to spore-based chemiluminescence system for glyphosate detection.
草甘膦（Glyp）的广泛使用引发环境和健康风险，亟需高选择性、低成本且易操作的检测方法。本研究通过定向进化从枯草芽孢杆菌甘氨酸氧化酶（BceGO）获得偏好草甘膦的草甘膦氧化酶（GlypO，B5R18）。与野生型相比，GlypO 对草甘膦的催化效率、特异性常数和亲和力增强因子分别提高 2.85×10^3、2.25×10^5 和 9.6...
Design, Evolution, and Characterization of a Xylose Biosensor in
遗传编码生物传感器广泛用于合成生物学和代谢工程，但已报道的木糖生物传感器过于敏感且工作范围有限，难以满足多数传感应用。本研究对大肠杆菌 XylR 进行定向进化，并构建基于 XylR 及其操纵子 xylO 的木糖生物传感器。含突变 XylR 的传感器工作范围较对照提高近 10 倍；XylR 中单个氨基酸突变 L73P 或 N220T ...
Directed evolution of a transcription factor PbrR to improve lead selectivity and reduce zinc interference through dual selection.
定向进化已被证明是开发具有新颖或增强功能蛋白和菌株的有力工具。本研究设计了一种双选择系统，以氨苄青霉素抗性基因 amp 作为正选择标记，以果聚糖蔗糖酶基因 sacB 作为负选择标记，用于调节转录因子对特定配体的结合特异性。该系统被应用于本实验室此前构建的铅响应转录因子 PbrR 全细胞铅生物传感器。经过多轮 ON–OFF 选择，筛选...
Immobilized dye-decolorizing peroxidase (DyP) and directed evolution variants for hydrogen peroxide biosensing.
本研究以固定化来自 Pseudomonas putida MET94 的染料脱色过氧化物酶（PpDyP）及其三个定向进化（DE）变体为对象，旨在开发用于过氧化氢（H2O2）检测的生物传感器。通过共振拉曼（RR）和表面增强共振拉曼（SERR）光谱考察酶在溶液及固定化状态下的结构性质，并通过电化学方法分析其电催化性能。野生型（wt）和 ...
NADPH biosensor-based identification of an alcohol dehydrogenase variant with improved catalytic properties caused by a single charge reversal at the protein surface.
醇脱氢酶（ADHs）可用于还原性生物转化生产手性醇。本研究基于 NADPH 生物传感器 pSenSox 和荧光激活细胞分选（FACS），对乳酸乳杆菌来源的 NADPH 依赖型醇脱氢酶 LbADH 进行高通量筛选，寻找将 2,5-己二酮还原为 (2R,5R)-己二醇活性更高的变体。通过易错 PCR 构建约 1.4×10^6 个克隆的随...
Evolution-guided engineering of small-molecule biosensors.
变构转录因子（aTFs）作为配体特异性生物传感器，可实时监测、筛选和调控细胞代谢，但其特异性及配体浓度与输出信号之间的转移函数常需优化。本文提出一种通用高通量方法，在酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 中进化原核 aTF 的特异性和转移函数。通过对效应结合域（EBD）进行单轮错误 PCR 突变，并结合多种开关...
Directed evolution of the PcaV allosteric transcription factor to generate a biosensor for aromatic aldehydes.
基于变构转录因子（aTF）的生物传感器可用于检测代谢物和工业分子，但现有方法多依赖有限的天然 aTF，因此改变其配体特异性以识别新效应物具有重要意义。本研究以 Streptomyces coelicolor 的 PcaV 阻遏蛋白（MarR 家族 aTF）为基础，构建了检测羟基取代苯甲酸（包括原儿茶酸 PCA）的遗传编码生物传感器，...
Switching the Ligand Specificity of the Biosensor XylS from
假单胞菌 XylS 转录激活因子在苯甲酸类效应物存在下诱导 Pm 启动子转录，间甲苯酸最有效，对甲苯酸较弱。为改变其效应物特异性，作者在 E. coli 中建立双选择系统：Pm 启动子控制 bla 和 tetR，tet 启动子控制 cat。氨苄青霉素抗性用于正选择，富集识别目标配体的 XylS 突变体；氯霉素敏感性用于负选择，排除识...
Synthetic biology for evolutionary engineering: from perturbation of genotype to acquisition of desired phenotype.
随着生物基产业受到关注，快速有效改良菌株的技术需求显著增加。进化工程对生物学信息依赖较低，已被用于菌株改良。近年来，合成生物学在进化工程中取得重要进展，尤其发展了用于表型扰动的合成工具；同时，发现具有调控功能的生物部件并设计新型遗传回路，也推动了高通量筛选与选择。本综述首先简述用于诱变和筛选改良变体的合成生物学工具基础，随后描述这些...
Phage-Assisted Evolution of Bacillus methanolicus Methanol Dehydrogenase 2.
合成甲基营养是指改造大肠杆菌等微生物使其以甲醇为碳源生长，是代谢工程与合成生物学的长期目标。NAD 依赖型甲醇脱氢酶（Mdh）是多数甲醇同化途径中的第一个酶，其较差的动力学性质限制途径通量，是合成甲基营养的主要瓶颈。为突破该瓶颈，作者利用甲醛生物传感器建立了噬菌体辅助非连续进化（PANCE）选择系统，用于筛选 Bacillus me...
Engineering ClpS for selective and enhanced N-terminal amino acid binding.
单分子蛋白质测序的核心挑战之一，是对肽链中特定氨基酸进行高保真顺序识别与检测。N端规则通路适配蛋白ClpS可天然识别肽链N端氨基酸（NAA），野生型对N端Phe具有较高特异性但亲和力有限，同时也能识别Trp、Tyr和Leu。本研究采用定向进化方法，筛选对Phe和Trp具有更高亲和力与选择性的ClpS变体。以根癌农杆菌ClpS2为骨架...
Engineered Biosensors from Dimeric Ligand-Binding Domains.
生物传感器是合成生物学和代谢工程应用中的重要组成部分。本文报道了基于失稳二聚体配体结合域的第二代酿酒酵母地高辛和孕酮生物传感器，其通过配体诱导稳定发挥作用。该生物传感器由一个配体结合域单体融合 DNA 结合域、另一个融合转录激活域组成，在配体结合和受体二聚化后激活报告基因表达。在二聚界面引入失稳突变使生物传感器动态范围提高一个数量级...
A Biosensor Strategy for E. coli Based on Ligand-Dependent Stabilization.
工程化微生物以监测环境化学物质或生产目标生物产品通常依赖合适的生物传感器，但将配体结合蛋白转化为生物传感器较为困难。本文报道了一种在大肠杆菌中构建生物传感器的一般策略：利用配体依赖性稳定转录激活蛋白，实现报告基因表达随配体浓度变化。作者以 LacI 作为配体结合域，将其与 Zif268 DNA 结合域和 RNA 聚合酶 ω 亚基 R...
A dual system using compartmentalized partnered replication for selection of arsenic-responsive transcriptional regulator.
本文提出一种用于筛选砷响应转录调控因子的正负双选择系统。首先，作者构建了以大肠杆菌 BL21(DE3) 为宿主、以 ArsR 转录调节蛋白和 GFP 报告基因为核心的全细胞生物传感器，用于检测液相样品中的亚砷酸盐 As(III)。该传感器采用双质粒系统：pET29-arsR 在 T7 启动子控制下表达 ArsR，pACYC-gfp ...
Directed Evolution of Membrane Transport Using Synthetic Selections.
膜转运体的功能与底物特异性研究受限于实验数据不足，且序列-功能关系难以预测。本文利用配体响应型生物传感器系统，将底物摄取与大肠杆菌生长偶联：只有当细胞表达能转运特定配体的转运体时，配体进入细胞并磷酸化为硫胺素焦磷酸（TPP），TPP 结合核糖开关，启动抗生素抗性基因表达，使细胞在抗生素选择培养基中存活。作者将该合成选择系统用于定向进...