荧光寿命成像（FLIM）是一种可与共聚焦成像结合的强有力成像模式。基于分子内 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器中，供体荧光衰减时间的变化可提供内在定量信息。本文描述了一种用于定量钙离子（Ca2+）成像的共聚焦 FLIM 方案，采用以肌钙蛋白 C 为 Ca2+ 感应单元的基因编码 FRET 钙传感器 TN-XL，并...
在活体系统中实时监测蛋白质相互作用对理解复杂生物学过程至关重要。荧光共振能量转移（FRET）结合荧光寿命成像（FLIM）是监测蛋白-蛋白相互作用最准确的方法之一，但传统激光扫描 FLIM 获取单帧图像需数分钟，难以用于动态活细胞与体内过程。本文提出一种衍射极限、大规模并行、时间分辨多焦点多光子显微镜（MM-FLIM），通过飞秒激光束...
cGMP依赖性蛋白激酶I（PKGI）在调控血管平滑肌细胞（SMC）表型中起重要作用，但其核定位机制及核内功能仍不清楚。本研究表征了PKGIγ——一种经蛋白水解产生的PKGI激酶片段——中的核定位信号（NLS）。利用表达野生型和NLS突变型PKGIγ的细胞、小分子核转运抑制剂以及免疫定位实验，发现PKGIγ含有组成型活性NLS，其核区...
细胞对机械输入表现出多样响应，有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联介导机械刺激后的生物学效应。尽管 MAPK 通路可相对独立运行，但多种机制促进级联组分间串扰；然而潜在分子相互作用的组合复杂性阻碍了对协同功能的理解。为分析 MAPK 信号网络对机械应力的可塑性，作者在静息和拉伸条件下进行非饱和上位性筛选，并以 JNK 响应型 dJ...
铜是必需微量元素，参与多种人体酶功能，铜缺乏或铜转运遗传缺陷可导致严重甚至致命疾病。Rae等曾预测细胞质中游离铜离子水平极低，通常低到难以观测。我们近期开发了一种人源脱辅基碳酸酐酶II（hCA II）变体，用于金属离子传感，其对Cu(II)相对于Zn(II)的选择性比野生型蛋白提高25倍，从而能够在普通细胞皮摩尔游离锌存在下准确测量...
本文提出一种基于波动分析的成像方法，用于定量研究蛋白寡聚化如何调节多功能蛋白的信号活性。作者以 Rac1 FRET 生物传感器为对象，在活细胞中记录荧光寿命成像（FLIM）数据，并使同一数据格式同时支持相位（phasor）分析与交叉 Number and Brightness（cN&B）分析。通过该方法，可测量 Rac1 传感器在细...
在生物传感器中，遗传编码的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器被广泛用于在活细胞或组织中定位并测量酶活性。激酶活性尤其重要，因为其时空调控对理解细胞命运决定至关重要；ERK 是信号转导通路中的关键节点，可引导细胞进入不同生理过程。为在体内分析激酶并检测其活性的细微变化，需要更好的工具。本文报道了对先前 ERK 活性报告分子 EKA...
本章首先简要介绍荧光与荧光共振能量转移（FRET）的基本原理，随后重点讨论记录FRET最常用的方法，尤其关注广泛用于生物传感器成像的显微镜技术。文中比较了宽场荧光显微镜与激光扫描共聚焦显微镜的仪器选择，说明基于强度（如比率成像、受体光漂白）和基于供体荧光寿命（FLIM）的FRET检测方式，并给出将特定记录方法与具体科学实验相匹配的指...