遗传编码荧光生物传感器可将特定生物分子事件转换为可光学检测的信号，但成像生物分子过程常需修饰相关蛋白，且许多分子过程仍难以成像。本文提出一种利用荧光蛋白光学性质方向性这一此前被忽视检测原理的生物传感器设计。该传感器称为FLIPs，具有极其简单的设计、高灵敏度、多路复用能力、比率读出等优点，且无需修饰靶标。作者通过实时成像G蛋白偶联受...
磁小体是磁致旋细菌中储存铁生物矿物的膜结合囊泡样结构，其形成受约30个保守基因调控。为在哺乳动物细胞中实现铁的区室化并提供基于基因的磁共振成像对比，作者引入关键磁小体蛋白。此前在人黑色素瘤细胞中表达必需磁小体基因 mamI 和 mamL 的荧光融合蛋白，证实二者共定位并相互作用。本研究进一步利用共聚焦显微镜考察另外两个必需磁小体基因...
流式细胞术由流体系统和光学系统组成，已广泛用于生物传感。流体流动可实现样品自动高通量上样与分选，光学系统则通过荧光检测微米级细胞和颗粒。该技术功能强大且发展成熟，但要求样品以悬浮液形式存在，因此通常只能用于体外。本研究报道了一种简单方案，利用未经任何改造的共聚焦显微镜构建流式细胞术。作者证明，显微镜的快速线扫描能够有效激发毛细管中体...
HspA1A 是维持细胞稳态所必需的细胞质分子伴侣，也可定位于肿瘤细胞和应激细胞的质膜（PM）。然而，这种细胞质蛋白如何转位至 PM 尚不清楚。鉴于 HspA1A 可与磷脂酰丝氨酸（PS）等脂质结合，且脂质可招募蛋白至 PM，作者假设 HspA1A 与 PS 的相互作用使其定位于 PM。为此，作者对细胞施加温和热休克，并用共聚焦显微...
抗体在传感器表面的定向固定对提高免疫传感器的抗原结合能力和检测灵敏度至关重要。本研究报道了一种将抗布鲁氏菌免疫球蛋白G（IgG）定向吸附于硅表面的策略，利用金黄色葡萄球菌来源的蛋白A（SpA）作为定向固定元件。通过X射线光电子能谱（XPS）和原子力显微镜（AFM）对功能化表面的形貌、拓扑和化学组成变化进行表征，以确认各功能层的形成。...
基因编码的Förster共振能量转移（FRET）生物传感器可用于报告离子和小分子相对浓度、蛋白构象变化、翻译后修饰及蛋白相互作用，通常通过荧光强度比率分析定量。本文以拟南芥中检测无机磷酸盐（Pi）的FRET生物传感器cpFLIPPi-6.4m为例，建立了基于共聚焦显微镜的比率成像定量方法。作者对供体eCFP、受体cpVenus及FR...
荧光寿命成像（FLIM）是一种可与共聚焦成像结合的强有力成像模式。基于分子内 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器中，供体荧光衰减时间的变化可提供内在定量信息。本文描述了一种用于定量钙离子（Ca2+）成像的共聚焦 FLIM 方案，采用以肌钙蛋白 C 为 Ca2+ 感应单元的基因编码 FRET 钙传感器 TN-XL，并...
本研究开发了一种基于大鼠嗜碱性白血病细胞（RBL-2H3）的荧光生物传感器，用于检测和鉴定鱼类主要过敏原鱼白蛋白（parvalbumin, PV）。作者构建 CD63-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合质粒，并通过脂质介导的高效 DNA 转染方法将其导入 RBL 细胞，获得稳定转染的 RBL 细胞系，用于共聚焦激光扫描显微镜（CLS...
本章首先简要介绍荧光与荧光共振能量转移（FRET）的基本原理，随后重点讨论记录FRET最常用的方法，尤其关注广泛用于生物传感器成像的显微镜技术。文中比较了宽场荧光显微镜与激光扫描共聚焦显微镜的仪器选择，说明基于强度（如比率成像、受体光漂白）和基于供体荧光寿命（FLIM）的FRET检测方式，并给出将特定记录方法与具体科学实验相匹配的指...
细胞质钙离子浓度（[Ca2+]cyt）的变化是植物多种细胞信号转导通路的核心调控事件，也参与许多脂质介导的调控网络。由于钙信号在植物生长和环境响应中的关键作用，监测其时空动态对于理解细胞生理至关重要。本文描述了利用稳定表达黄色变色龙3.6（YC3.6）的拟南芥根细胞测量细胞质钙离子浓度的方法。YC3.6是一种钙离子敏感型荧光蛋白生物...
自噬在多种条件下参与细胞组分周转，既是稳态维持机制，也是质量控制机制，可选择性降解包括细胞器在内的细胞物质。若受损或多余线粒体未被清除，可能威胁细胞稳态与存活。在酿酒酵母中，营养缺乏（如氮饥饿）或损伤可诱导线粒体选择性自噬，即线粒体自噬。本文描述一种简单荧光显微镜方法，用于评估酵母细胞中的自噬，并重点展示监测线粒体自噬。该方法使用双...
斑马鱼是活体观察发育过程中细胞行为的理想模型。其体外受精使胚胎各发育阶段均易于操作，光学透明性则允许在完整胚胎自然环境中高分辨率成像细胞与分子动态。本文采用活体成像方法分析神经嵴细胞迁移以及神经元轴突生长和引导过程中的细胞行为。活体成像有助于理解调控细胞运动机制；为观察突起活动和分子动态等细节，标记单个细胞具有优势。在斑马鱼中，质粒...
磷脂酰肌醇 3,4,5-三磷酸 [PtdIns(3,4,5)P3] 是响应胞外激动剂、由磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3-kinase）在质膜短暂合成的强效膜结合信号分子。PtdIns(3,4,5)P3 可招募含 PH 结构域的效应蛋白，调控细胞增殖、生长、迁移及胰岛素信号，因此其水平必须被严格限制。肌醇多磷酸 5-磷酸酶家族通过去除 ...
本文从理论和实验上证明，可通过直接且系统地饱和受体分子激发态来定量 Förster 共振能量转移（FRET），并将该受体耗竭方法称为 satFRET。该方法可逆，适合时间分辨测量。作者基于供体-受体分子状态微分方程组的稳态解建立模型，并纳入测量过程中受体光漂白的影响。实验采用不同化学计量比的 Alexa 546-Alexa 633 ...