膜脂质在细胞膜双层中呈异质分布。在酿酒酵母中，面向胞质侧的二酰甘油（DAG）池从液泡膜到芽极化质膜两端富集，但其空间分布如何维持仍不清楚。本研究利用全基因组 DAG 荧光生物传感器筛选，鉴定了调控 DAG 空间分布的基因，富集于囊泡运输、脂质运输、磷脂和固醇代谢相关蛋白。部分突变体出现 DAG 主要错误定位至质膜，其中预测脂酶 Dr...
克隆细胞群体内的异质性是生物过程工程的关键瓶颈，尤其会降低生物生产产量。由于单细胞水平代谢物定量存在技术困难，现有研究难以系统刻画细胞代谢状态。本文提出一种基于单细胞生物传感器分析的模块化框架，利用遗传编码荧光生物传感器对酿酒酵母胞内代谢状态进行稳健表征，并用于检测与分离环境扰动及微生物细胞工厂中的同基因型异质性。作者发现急性与渐进...
化石燃料消耗加剧资源枯竭与环境污染，异戊醇、异丁醇等支链高级醇因性质接近汽油而成为下一代生物燃料候选。微生物发酵可提供绿色、可持续、可再生的替代路线，但异戊醇发酵产率尚未达到工业规模。本研究利用可诱导碱基编辑工具 Helicase-AID 构建基因组尺度连续扰动库，并结合异戊醇生物传感器进行高通量筛选，获得五个高产突变体。突变体均表...
核包膜是内质网的特化亚区，由内核膜（INM）和外核膜组成。尽管 INM 在基因组调控中至关重要，其脂质代谢仍了解有限。磷脂酸（PA）既是膜磷脂前体，也是三酰甘油（TAG）储存的关键中间体。作者利用酿酒酵母全基因组脂质生物传感器筛选，鉴定了调控 INM PA 稳态的因子，包括已知介导核脂质滴（nLD）生物发生的 Seipin。结果显示...
生长素是调控植物、细菌、真菌和动物生长、代谢与行为的重要信号分子，其中吲哚-3-乙酸（IAA）是最主要的天然生长素，也影响微生物定殖植物或动物的能力。理解真菌中生长素的合成与信号传导，有助于调控从农业土壤到人体肠道的跨界关系和微生物组。然而，真菌中尚缺乏具有高时空分辨率的生长素测量工具。本研究报道了一套用于模式酵母酿酒酵母（Sacc...
线粒体功能障碍或功能改变见于神经退行性疾病、肌肉骨骼疾病、癌症和正常衰老等多种疾病与状态。本文描述一种在活酿酒酵母细胞中以细胞和亚细胞分辨率评估线粒体功能的方法，采用基因编码、低侵入性的比率生物传感器。该传感器为线粒体靶向HyPer7（mtHyPer7），用于检测线粒体中的过氧化氢（H2O2）。它由线粒体信号序列、环化置换荧光蛋白以...
乙酸耐受对利用含高浓度乙酸的木质纤维素水解物构建稳健细胞工厂至关重要。本研究基于酿酒酵母内源转录因子 Haa1 构建乙酸生物传感器，用于筛选 CRISPRi 酵母菌株库；该库中 dCas9-Mxi 分别抑制每个必需或呼吸生长必需基因。通过流式细胞分选富集了乙酸保留更高的细胞群体，并证明这些高生物传感器信号细胞对乙酸更敏感。基于生物传...
过氧化氢（H2O2）是多种生物过程的毒性氧化副产物，胞内水平过高会引发氧化应激，促使细胞启动保护性应答。传统活性氧荧光染料在特异性和时空分辨率上存在局限，而遗传编码荧光指示剂（GEFI）能够特异性检测低水平胞内 H2O2。本方案介绍一种高灵敏度 GEFI roGFP2-Prx1 在酿酒酵母 Saccharomyces cerevis...
支链氨基酸（BCAA）代谢具有多种生理功能，并可被用于生产高价值化学品。然而，目前缺乏特异性针对 BCAA 衍生产物的真核生物传感器，限制了用于菌株工程与代谢研究的高通量筛选的发展。本研究利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）转录调控因子 Leu3p 开发了一种遗传编码的 BCAA 代谢生物传感器。在一种构...
线粒体氧化还原状态是反映线粒体功能状态的重要指标，线粒体也是细胞内源性活性氧（ROS）的主要来源，因此其氧化还原状态还可反映 ROS 产生功能。本文提供在出芽酵母中利用活细胞成像与定量分析线粒体氧化还原状态和线粒体 ROS 的逐步实验方案。方案采用遗传编码荧光生物传感器线粒体靶向氧化还原敏感绿色荧光蛋白（mito-roGFP）检测线...
本文提出将机理模型与机器学习模型相结合，用于实现从基因型到表型的准确预测，并指导代谢工程。作者首先利用基因组规模代谢模型筛选影响色氨酸生产的关键基因靶点，结合转录组数据挖掘选择30个表达水平多样的启动子，构建由5个基因和6种启动子组合组成的7776个组合设计文库。随后开发基于大肠杆菌TrpR-GAL4激活域融合蛋白的酵母色氨酸荧光生...
三磷酸腺苷（ATP）是代谢中主要的自由能载体。在酿酒酵母中，转入富葡萄糖条件会引起 ATP 水平的动态变化，但单细胞层面这些动态的异质性尚不清楚；同时胞内 pH 也会变化，并影响基于荧光的单细胞生物传感器读数。为可靠测量单个酵母细胞中的 ATP 变化，作者开发了 yAT1.03，即 AT1.03 ATP 生物传感器的改进版本，使其对...
顺丁烯二酸是生产尼龙、聚氨酯和对苯二甲酸的潜在平台化合物，但目前尚无经济可行的生产工艺。为挖掘提高酿酒酵母中 cis,cis-顺丁烯二酸（CCM）产量的新遗传靶点，本研究采用宽动态响应的 CCM 生物传感器驱动绿色荧光蛋白（GFP）表达，对 CCM 产生酵母的紫外诱变库进行筛选。通过荧光激活细胞分选（FACS）获得突变株 Mut13...
细胞群体中个体细胞间的代谢异质性给基础与应用研究带来挑战。识别代谢异质性并研究其产生机制，需要能够深入单个细胞代谢的工具。虽然已有方法可测量单细胞代谢物水平，但尚缺乏在单细胞水平测量代谢通量——即代谢活动最终功能输出——的能力。本研究结合启动子工程、计算蛋白设计、生化方法、蛋白质组学和代谢组学，开发了一种用于测量单细胞酵母糖酵解通量...
为在工业规模上生产高价值化学品，酿酒酵母的代谢工程需要广泛调控其代谢。本文鉴定了新的基因表达微调策略，以增强内源代谢通量，提高乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平。将基于dCas9的转录调控与响应丙二酰辅酶A的胞内生物传感器结合，用于筛选有益调控组合。候选基因由基因组尺度代谢模型预测，并设计了靶向168个基因的gRNA文库。经多轮荧光激活细...
细胞内pH和氧化还原状态对多种生物学过程至关重要，并部分决定细胞行为。本研究开发了一种遗传编码双功能荧光探针pHaROS，用于在活细胞中同时实时检测氧化还原电位和pH的动态变化。pHaROS由拟南芥黄素单核苷酸结合荧光蛋白iLOV和mKATE变体mBeRFP融合而成。在酿酒酵母中，作者证实H2O2处理可提高细胞整体氧化还原电位，并伴...
脂肪酸衍生物在化学构建块到生物燃料等工业领域应用广泛。由于脂肪酸代谢高度动态，难以通过理性方法鉴定调节脂肪酸酰-CoA水平的基因。代谢物生物传感器可用于在体内以高通量方式筛选大规模基因库。本文在酿酒酵母中建立了基于大肠杆菌转录因子 FadR 的脂肪酸酰-CoA传感器，并与基因过表达库结合，筛选提高脂肪酸酰-CoA池的基因。经流式细胞...
尽管已有多种策略使酿酒酵母利用木糖，但木糖利用速率仍远低于葡萄糖。许多研究表明，工程酵母虽能在木糖上生长和发酵，却未将木糖识别为可发酵碳源，形成“木糖悖论”。作者此前利用荧光生物传感器菌株在体内监测表达木糖还原酶/木糖醇脱氢酶（XR/XDH）途径的酵母糖信号组，发现高浓度木糖触发与低浓度葡萄糖相同的信号，这可能解释木糖利用不佳。本研...
近年来，重组细胞中 D-葡萄糖酸（GA）生产取得进展，亟需高通量筛选和选择性能更优的重组细胞或生物催化剂。2016 年已开发一种在大肠杆菌中将 GA 浓度转化为荧光信号的生物传感器系统，但其应用报道较少。本文建立了一种不依赖微流控平台等专用装置的有效高通量筛选方法，并进行初步应用。在该一锅双菌株体系中，含有 GA 合成途径的产酸菌或...
血红素是必需辅因子和信号分子，也可能具有细胞毒性。为限制游离血红素，细胞通常将血红素合成与利用紧密偶联，但稳态可交换血红素（labile heme, LH）池是否支持血红素依赖过程仍不清楚。作者以酿酒酵母为模型，结合荧光血红素传感器、位点特异性血红素螯合剂和分子遗传学方法，发现：（1）在血红素耗竭条件下，酵母优先利用LH；（2）螯合...