基因编码的FRET生物传感器可在活细胞中实时观察特定酶活性的空间与时间变化。作者此前报道了特异性识别Zeta相关蛋白70 kD（ZAP-70）的FRET生物传感器；ZAP-70是Syk家族蛋白酪氨酸激酶，对早期T细胞受体（TCR）信号、T淋巴细胞发育以及整合素介导的T细胞迁移至关重要。为便于研究免疫突触形成或细胞迁移等动态过程中的Z...
二维培养常用于药物测试，但难以反映肿瘤内部细胞的空间相互作用；三维培养可模拟实体瘤结构，却难以长期评估药物效应，因此需要实时、纵向分析平台。本研究将编码荧光共振能量转移（FRET）生物传感器的质粒 DNA 转染人乳腺癌细胞，建立 MCF7-C3 和 MDA-MB-231-C3 细胞系，用于检测 caspase-3 激活。健康细胞呈绿...
小 GTP 酶 Rab13 参与上皮细胞外泌体囊泡运输，其活性改变与人类癌症相关，但激活机制及在肿瘤进展中的作用不清。本研究鉴定 DENN 结构域蛋白 DENND2B 为 Rab13 的鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF），并开发一种基于 Förster 共振能量转移（FRET）的新型 Rab13 生物传感器，用于在活细胞中实时监测 Ra...
体内细胞会受到多种力学刺激，但细胞响应机械刺激的细节仍不清楚。本文证明，将激光诱导冲击波（LIS）与基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器相结合，是研究单活细胞生物过程的一种有前景的新方法。作为概念验证，作者利用FRET钙生物传感器D3CPV，在激光诱导冲击波作用下观察到牛动脉内皮细胞释放胞内钙。在所用激光参数下，细胞保持原有...
环磷酸腺苷（cAMP）是多种G蛋白偶联受体（GPCR）的第二信使，细胞内cAMP水平变化常被用于评估GPCR特异性配体的生物活性。FRET生物传感器已用于cAMP检测，其比率敏化发射（SE）检测可在荧光微孔板读仪上实施，但需要细胞表达足够且可重复的传感器蛋白。本章介绍利用BacMam杆状病毒转导系统实现cAMP FRET生物传感器（...
人表皮生长因子受体2/Neu（HER2/Neu）在约30%的乳腺癌中过表达，主要通过Ras–Raf–MEK–ERK通路传递生长信号，但乳腺癌组织中ERK活性高低与预后关系仍有争议。为阐明ERK活性在乳腺癌进展中的作用，作者将MMTV-Neu转基因小鼠与表达ERK荧光共振能量转移（FRET）生物传感器EKAREV的转基因小鼠杂交，利用...
蛋白激酶A（PKA）调控细胞周期等多种细胞过程。本研究利用遗传编码的FRET生物传感器，基于AKAR衍生的AKAREV探针，在活HeLa细胞中以单细胞水平表征有丝分裂过程中PKA活性。结果显示，HeLa细胞进入中期后PKA活性显著升高，并维持至胞质分裂/末期结束。采用AKAREV T>A失活突变体和H89抑制剂验证了所测PKA活性的...
优化酪氨酸激酶抑制剂在肿瘤中的疗效仍是重要研究方向。活体成像可作为药物发现工具，用于在活体肿瘤中实时监测药物靶点特异性荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，从而深入了解药物在肿瘤内的递送与药效动力学。本文概述了作者近期利用 Src-FRET 生物传感器作为 Src 激酶活性读出指标，评估达沙替尼（dasatinib）不同给药方案下...
Src 激酶在剪切应力诱导的血管细胞反应中起关键作用，但高剪切应力（HSS）诱导 Src 激活的亚细胞时空模式仍不清楚。本研究对牛主动脉内皮细胞（BAECs）施加 65 dyn/cm2 的 HSS，利用基于荧光共振能量转移（FRET）的膜靶向 Src 生物传感器 Kras-Src，在亚细胞水平实时可视化 Src 激酶活性。结果显示，...
本文提出一种将全内反射荧光（TIRF）显微镜与稳态受体荧光各向异性测量相结合的活细胞成像系统，用于在细胞质膜处进行 Förster 共振能量转移（FRET）成像。作者直接比较了偏振分辨 TIRF 与透射荧光激发下的成像性能，并针对高数值孔径物镜在 TIRF 中引入的额外去极化效应进行了校正。该系统通过测量 Raichu-Cdc42 ...
本研究利用双光子荧光显微镜和有意识固定光学生物传感器小鼠，原位检测小鼠耳部小动脉平滑肌细胞内钙离子（[Ca2+]i）。ExMLCK 小鼠在平滑肌中表达遗传编码 FRET 钙指示剂 exMLCK，并植入血压遥测装置以维持正常平均动脉压（MAP）和交感神经活动（SNA）。固定后有意识小鼠 MAP 为 101±4 mmHg，与自由活动 1...
理解细胞信号网络的信息处理机制，需要在活细胞中对特定信号蛋白的活性进行定量测量。生物传感器是用于直接追踪信号蛋白活性的分子探针，其应用正在革新信号转导研究。现有定量分析通常假设生物传感器活性与其所追踪的信号蛋白活性近似线性相关。本文针对常见单链 FRET 生物传感器架构建立机制数学模型，同时纳入分子内与分子间反应，检验该线性假设的有...
生物传感器可用于疾病生物标志物识别以及活细胞内特定分子时空分布检测。当前主要挑战是如何将生物识别域与输出模块功能偶联，使结合事件转化为可见且可定量的信号，例如 Förster 共振能量转移（FRET）。多数设计依赖结合蛋白与靶标相互作用后发生构象变化，但天然具有此类变构机制的蛋白很少，且构象变化常不足以产生足够大的供体-受体距离变化...
细胞对机械输入表现出多样响应，有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联介导机械刺激后的生物学效应。尽管 MAPK 通路可相对独立运行，但多种机制促进级联组分间串扰；然而潜在分子相互作用的组合复杂性阻碍了对协同功能的理解。为分析 MAPK 信号网络对机械应力的可塑性，作者在静息和拉伸条件下进行非饱和上位性筛选，并以 JNK 响应型 dJ...
细胞机械微环境对细胞功能具有重要影响，基质刚度可指导干细胞分化，但其机制尚不清楚。本文报道，在人源间充质干细胞（HMSCs）中，基质刚度可调节细胞对β-肾上腺素受体（β-AR）激动剂异丙肾上腺素（ISO）的反应。基于荧光共振能量转移（FRET）的A激酶活性报告蛋白（AKAR2）显示，软基质上ISO诱导的蛋白激酶A（PKA）活性较低，...
Cdc42 是调控细胞极性、细胞骨架重排、迁移和膜转运等多种形态发生过程的关键小 GTP 酶，其激活动态需精确调控。为在活细胞中直接观察 Cdc42 激活，作者开发并验证了一种新的 Cdc42 激活生物传感器。该传感器为遗传编码、单链设计，可正确定位到膜区室，并能与其上游调控因子鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子（GDI）相互作用。作者在小鼠...
小分子配体激活的G蛋白偶联受体通常被认为在反复或持续刺激后数分钟内通过受体磷酸化和内化迅速脱敏，这与许多长期细胞和生理反应相矛盾。本研究利用基于FRET的cAMP生物传感器进行活细胞成像，并结合心肌细胞收缩实验，发现儿茶酚胺激活的β1肾上腺素能受体（β1AR）在原代心肌细胞和神经元中持续刺激腺苷酸环化酶（AC）合成第二信使cAMP，...
Rac小G蛋白家族具有多种调控因子，可将胞外信号整合为紧密的时空活性图谱，从而促进特定细胞形态与反应。本研究构建了一种Rac-FRET小鼠品系，使其普遍表达Raichu-Rac生物传感器，从而能够在活体组织和原代细胞中进行FRET成像与Rac活性定量，而不影响细胞特性与反应。我们评估了趋化性Rac-FRET中性粒细胞中的Rac活性，...
本文提出一种基于波动分析的成像方法，用于定量研究蛋白寡聚化如何调节多功能蛋白的信号活性。作者以 Rac1 FRET 生物传感器为对象，在活细胞中记录荧光寿命成像（FLIM）数据，并使同一数据格式同时支持相位（phasor）分析与交叉 Number and Brightness（cN&B）分析。通过该方法，可测量 Rac1 传感器在细...
星形胶质细胞形态可能受cAMP调节，并影响其与突触的结构关联。β-肾上腺素能受体（β-AR）可升高胞内cAMP浓度（[cAMP]i），但单活星形胶质细胞中β-AR介导cAMP信号的实时动态及其形态效应尚未研究。作者使用FRET cAMP生物传感器Epac1-camps，实时监测原代大鼠星形胶质细胞中[cAMP]i变化，并用共聚焦显微...