在同一个活细胞中同时成像两种或多种荧光生物传感器，可揭示蛋白质活性在时空上的协调关系。然而，同时使用多个 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器存在毒性较高且需要光谱正交荧光团等困难。本研究构建了一种可特异性结合三种不同蛋白激活构象的生物传感器组分，从而用更少荧光团实现多路复用 FRET 并降低毒性。作者通过组合下游效应...
Rho家族GTP酶是细胞骨架动态的核心调控因子，其活性受鸟苷酸交换因子（RhoGEF）和GTP酶激活蛋白（RhoGAP）调控。本方案提供一套稳健、可高通量筛选的活细胞荧光共振能量转移（FRET）生物传感器检测流程，用于在天然细胞环境中分析RHOA、RAC1和CDC42等GTP酶活性变化。该传感器为遗传编码单链报告蛋白，包含循环置换m...
FRET 生物传感器比率成像的准确性受信噪比限制，尤其在细胞边缘等低体积区域，背景扣除和除以小数值会产生明显伪影。本文提出噪声校正因子（NCF）方法，不再分别对分子和分母做背景扣除，而仅从 FRET 分子中扣除一个由背景噪声分布或高信噪比区域比率推导的校正因子，从而避免边缘处除以弱信号造成的偏差。作者首先用均匀分布且不相互作用的 m...
ADAMTS（含血小板反应蛋白基序和金属蛋白酶域的血栓反应蛋白基序金属蛋白酶）是一类依赖Zn2+/Ca2+的分泌型蛋白酶，参与细胞外基质重塑及多种生理病理过程。本研究探讨ADAMTS-1是否参与细胞侵袭与迁移及其机制。作者通过条件培养基处理或CRISPR/Cas9敲除，改变卵巢癌细胞（CHO、NIH-OVCAR-3、ES-2）和NI...
本文通过在多种鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）共有的结构铰链区插入荧光蛋白对，构建了用于检测 Dbl 家族 RhoGEF 活性的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器。荧光生物传感器可映射信号分子在活细胞中的时空激活，但此前难以量化不同激活事件如何相互影响或贡献特定细胞行为。作者将 GEF 生物传感器与红移 Rho GTPase 生物...
由于现有遗传编码探针存在光谱重叠，直接可视化并光控多个细胞过程具有挑战。本文报道迄今最红移的单体近红外（NIR）荧光蛋白 miRFP720，以及全近红外 Förster 共振能量转移（FRET）对 miRFP670–miRFP720，使所设计的生物传感器能够与 CFP–YFP 成像和蓝绿光遗传学工具兼容。作者开发了 Rac1 GTP...
鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子（GDI）是 Rho 家族 GTP 酶的重要负调控蛋白，可将 GTP 酶隔离在细胞膜外。本文研究 GDI–Cdc42 相互作用如何调控细胞运动中的局部 Cdc42 激活。由于细胞对 Rho 家族通路组分过表达敏感，作者开发了新型生物传感器 GDI.Cdc42 FLARE：在 Cdc42 上引入荧光共振能量转移...
侵袭体是富含肌动蛋白的膜突起，可降解细胞外基质并驱动肿瘤侵袭；c-Src 与 Rho 家族 GTP 酶是其关键调控因子。侵袭体可重组为环状玫瑰花结，但机制不明。本文发现，A375M 与 MDA-MB-435 黑色素瘤细胞中 Src 诱导的侵袭体可被 GPCR 激动剂快速重塑为动态基质降解玫瑰花结，尤其是 LPA（经 LPA1）和内皮...
Rho家族p21小GTP酶直接调控基于肌动蛋白的运动机器，在细胞迁移控制中起关键作用。除经典且研究最充分的RhoA、Rac1和Cdc42外，这些关键蛋白的多个亚型已被鉴定，并显示在多种细胞运动过程中具有特定功能。研究亚型特异性效应的主要困难在于，各亚型一级氨基酸序列高度相似，因此可与相同上游调控因子和下游效应靶点相互作用。本文介绍各...
生物传感器可用于在体内监测多种蛋白行为，但新传感器的开发与表征往往耗时费力。在传感器设计过程中，需要评估不同结构对特异性、亮度和荧光响应的影响。本文描述一种在 96 孔板格式下使用自动化显微镜进行生物传感器验证的高通量方法。该方法将生物传感器与能够刺激或抑制其报告活性的上游蛋白共表达，从而确定传感器最大激活态与失活态之间的差异，并考...
Cdc42 是调控细胞极性、细胞骨架重排、迁移和膜转运等多种形态发生过程的关键小 GTP 酶，其激活动态需精确调控。为在活细胞中直接观察 Cdc42 激活，作者开发并验证了一种新的 Cdc42 激活生物传感器。该传感器为遗传编码、单链设计，可正确定位到膜区室，并能与其上游调控因子鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子（GDI）相互作用。作者在小鼠...
基于 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器可用于在活细胞中以亚细胞分辨率和秒级时间尺度解析蛋白激活事件的动态过程，这些过程难以用传统生化和细胞生物学方法直接观察。本文系统介绍将 FRET 生物传感器原始图像数据转化为相对比率定量测量的基本图像处理流程，重点讨论遗传编码单链 FRET 传感器以及分子间双链设计系统的处理...
本文提出一种基于波动分析的 FRET 生物传感器检测方法，用于在活细胞中同时测量蛋白质的分子流与信号活性。作者将荧光寿命成像显微镜（FLIM）的相量（phasor）分析与沿毫秒级线扫描获取的交叉对关联函数（cross-pCF）分析相结合，检测 Rho GTPase 活性（即 FRET 生物传感器信号）的空间定位，并解析该活性群体所采...
本文提供了在单通道和多通道成像模式下对Rho家族GTPase生物传感器进行活细胞成像的实验程序。多通道方法可在单个活细胞中直接同时可视化两种生物传感器读数。作者以基于CFP/YFP FRET的RhoA生物传感器和基于溶剂极性敏感有机染料的Cdc42生物传感器为例，系统列出实现双比率型生物传感器成像所需的光学组件、滤光片、二向色镜、分...
Rac1、RhoA 和 Cdc42 等 Rho 家族 GTPase 协同调控细胞骨架动态，但它们在单个细胞突出事件中秒级、微米级的时空协调仍不清楚。本研究在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中，利用两种 GTPase 荧光生物传感器的同步成像，以及一种以突出/回缩事件为共同时间参考的“计算多重化”方法，分别测定 Rac1、Cdc42 和 ...