Intravital microscopy of biosensor activities and intrinsic metabolic states.
体内显微镜（IVM）是一种可在活体动物组织中实时检测亚细胞信号或代谢事件的成像工具。然而，在高散射生物组织中成像时，激发光与发射光随深度增加而衰减，深度依赖性信号衰减是 IVM 的主要限制，使定量测量变得困难。因此，IVM 定量分析需要采用内部校准探针，或采用不同于强度测量的信号评估方式。本文描述了如何利用基因编码生物传感器探针的比...
Transient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis.
不可切除胰腺癌患者的新兴标准治疗是吉西他滨与白蛋白紫杉醇（Abraxane）联合化疗，但患者反应仍有限。胰腺癌发生与转移发生在复杂微环境中，微环境线索与疾病进展和药物反应之间存在双向反馈。化疗前序贯双重靶向肿瘤组织张力与血管如何影响肿瘤反应尚不清楚。作者利用活体成像评估使用药物Rho激酶抑制剂法舒地尔（Fasudil）对肿瘤组织进行...
Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy.
本文介绍一种开源高内容分析（HCA）仪器，利用自动荧光寿命成像（FLIM）对多孔板中固定或活细胞进行Förster共振能量转移（FRET）读出，以检测蛋白相互作用、寡聚化、异二聚化及细胞信号过程。该系统基于宽场时间门控成像，采用门控光学图像增强器（GOI）、延迟发生器和冷却CCD相机，结合Nipkow旋转盘实现光学切片，可在每个视野...
Detecting intratumoral heterogeneity of EGFR activity by liposome-based in vivo transfection of a fluorescent biosensor.
尽管 EGFR 靶向抗癌药物已广泛进入临床，但总体生存获益有限，肿瘤内异质性被认为是治疗失败的重要机制。本研究应用荧光寿命显微镜（FLIM）生物传感技术，在活体肿瘤中检测 EGFR 活性异质性。作者使用遗传编码的 CrkII 基 FRET 生物传感器 Picchu-X，其 Y221 位点被 EGFR 磷酸化后发生构象变化，改变 eG...
De novo phosphorylation and conformational opening of the tyrosine kinase Lck act in concert to initiate T cell receptor signaling.
Src 家族酪氨酸激酶 p56Lck（Lck）的活性受 Tyr394 和 Tyr505 磷酸化调控。Tyr394 磷酸化和 Lck 构象开放被认为激活激酶，而 Tyr505 磷酸化形成关闭、失活构象。作者利用高灵敏度 FRET 生物传感器 TqLck-V2 和荧光寿命成像显微镜（FLIM），在未经刺激和 T 细胞受体（TCR）刺激后...
Investigation of the NADH/NAD
Ralstonia eutropha 是一种可氧化氢的细菌，能在异养与自养代谢之间切换，因而适用于生物氢生产、可降解聚合物和烃类等生物技术。其 H2 氧化在 O2 存在下由四种氢化酶介导，其中可溶氢化酶（SH）可逆地耦合 H2 氧化与 NAD+ 还原为 NADH，并已在体外和体内用于辅因子再生，因此 SH 与细胞 NADH/NAD+...
A FRET biosensor reveals spatiotemporal activation and functions of aurora kinase A in living cells.
AURKA过表达是上皮癌的重要标志。其编码多功能丝氨酸/苏氨酸激酶Aurora A，该激酶在中期被激活并参与细胞周期进程；在活细胞中评估其激活状态对下一代药物设计至关重要。本文报道一种Förster共振能量转移（FRET）生物传感器，用于检测Aurora A激酶在Thr288位点自磷酸化所诱导的构象变化。该传感器由EGFP供体、全长...
Imaging of Metabolic Status in 3D Cultures with an Improved AMPK FRET Biosensor for FLIM.
本文提出利用表达于肿瘤球体内的 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器，非侵入性绘制三维细胞培养中生化与生理变化的时空分布。重点报道改进的 AMP 活化蛋白激酶（AMPK）FRET 生物传感器 T2AMPKAR（mTurquoise2 AMPK Activity Reporter），用于荧光寿命成像（FLIM）读出，并在...
Visualising apoptosis in live zebrafish using fluorescence lifetime imaging with optical projection tomography to map FRET biosensor activity in space and time.
荧光寿命成像（FLIM）与光学投影断层成像（OPT）相结合，有望在完整透明或近透明活体（如斑马鱼幼鱼）中于空间和时间上绘制 Förster 共振能量转移（FRET）读出，从而在生理背景下可视化细胞信号过程。本文首次报道将 FLIM-OPT 应用于活体转基因斑马鱼幼鱼，利用遗传表达的 FRET 生物传感器读取生物功能。通过成像可被 C...
HyPer Family Probes: State of the Art.
过氧化氢（H2O2）不仅是氧化应激的关键介质，也是重要的细胞第二信使，参与调控多种细胞信号通路。遗传编码荧光生物传感器 HyPer 是研究活体系统中 H2O2 动态变化的有效工具。本文综述 HyPer 及其改进版本的结构、性能与应用进展。HyPer 由大肠杆菌转录因子 OxyR 的 H2O2 敏感调控域与环状置换黄色荧光蛋白 cpY...
Ubiquitination switches EphA2 vesicular traffic from a continuous safeguard to a finite signalling mode.
受体酪氨酸激酶（RTK）的自催化磷酸化可产生多样、依赖细胞环境的信号响应，但也带来配体非依赖的自主激活风险。作者构建了一种遗传编码的构象生物传感器 LIFEA2，用于在活细胞中实时报告 EphA2 激酶活性。该传感器将单体柠檬黄 mCitrine 插入 EphA2 近膜区（JMS），并将单体樱桃 mCherry 融合于 C 端，通过...
Persistent luminescence nanoprobe for biosensing and lifetime imaging of cell apoptosis via time-resolved fluorescence resonance energy transfer.
时间分辨荧光技术可通过在脉冲激发光与信号采集之间设置延迟时间，降低细胞和组织中短寿命背景发光及自发荧光的干扰。本文制备了持久发光纳米颗粒（PLNPs），并以此构建通用时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）平台，用于生物传感、细胞凋亡荧光寿命成像以及细胞内半胱天冬酶-3（caspase-3）的原位寿命定量。作者将染料标记的肽或 D...
Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors.
荧光生物传感器现已常规用于完整组织的双光子显微镜成像，例如脑片和活体动物脑。然而，多数研究测量的是时间变化，例如神经元活动引起的钙瞬变，而非经校准的生物传感器占据率（即被测分析物水平）。真正的定量测量具有挑战性，因为难以或无法在体内原位校准传感器的剂量–响应关系，也难以将组织中的光学信号与体外校准信号进行比较。双波长比率测量会受激光...
pH sensitivity of FRET reporters based on cyan and yellow fluorescent proteins.
通常认为，遗传编码报告蛋白中常用的青色和黄色荧光蛋白在接近生理pH范围内具有强pH敏感性。我们研究了这些pH响应对在活BHK细胞胞质中表达的模型FRET串联体和基于FRET的cAMP依赖性蛋白激酶活性报告蛋白（AKAR）胞内信号的影响，并通过尼日里菌素离子载体改变胞内pH。尽管供体和受体的同时pH敏感性在某些情况下可能相互掩盖，但与...
Development of a molecularly evolved, highly sensitive CaMKII FRET sensor with improved expression pattern.
基因编码的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器已被成功用于在活细胞中可视化蛋白质活性。FRET 测量的敏感性和准确性直接取决于生物传感器的折叠效率、表达模式、灵敏度和动态范围。为提高 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 IIα（CaMKIIα）FRET 传感器的折叠效率，作者利用易错聚合酶链式反应（PCR）扩增 CaMKIIα 基因...
Confocal FLIM of genetically encoded FRET sensors for quantitative Ca2+ imaging.
荧光寿命成像（FLIM）是一种可与共聚焦成像结合的强有力成像模式。基于分子内 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器中，供体荧光衰减时间的变化可提供内在定量信息。本文描述了一种用于定量钙离子（Ca2+）成像的共聚焦 FLIM 方案，采用以肌钙蛋白 C 为 Ca2+ 感应单元的基因编码 FRET 钙传感器 TN-XL，并...
Time-resolved multifocal multiphoton microscope for high speed FRET imaging in vivo.
在活体系统中实时监测蛋白质相互作用对理解复杂生物学过程至关重要。荧光共振能量转移（FRET）结合荧光寿命成像（FLIM）是监测蛋白-蛋白相互作用最准确的方法之一，但传统激光扫描 FLIM 获取单帧图像需数分钟，难以用于动态活细胞与体内过程。本文提出一种衍射极限、大规模并行、时间分辨多焦点多光子显微镜（MM-FLIM），通过飞秒激光束...
cGMP-dependent protein kinase I gamma encodes a nuclear localization signal that regulates nuclear compartmentation and function.
cGMP依赖性蛋白激酶I（PKGI）在调控血管平滑肌细胞（SMC）表型中起重要作用，但其核定位机制及核内功能仍不清楚。本研究表征了PKGIγ——一种经蛋白水解产生的PKGI激酶片段——中的核定位信号（NLS）。利用表达野生型和NLS突变型PKGIγ的细胞、小分子核转运抑制剂以及免疫定位实验，发现PKGIγ含有组成型活性NLS，其核区...
Plasticity of the MAPK signaling network in response to mechanical stress.
细胞对机械输入表现出多样响应，有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联介导机械刺激后的生物学效应。尽管 MAPK 通路可相对独立运行，但多种机制促进级联组分间串扰；然而潜在分子相互作用的组合复杂性阻碍了对协同功能的理解。为分析 MAPK 信号网络对机械应力的可塑性，作者在静息和拉伸条件下进行非饱和上位性筛选，并以 JNK 响应型 dJ...
Fluorescence lifetime imaging of physiological free Cu(II) levels in live cells with a Cu(II)-selective carbonic anhydrase-based biosensor.
铜是必需微量元素，参与多种人体酶功能，铜缺乏或铜转运遗传缺陷可导致严重甚至致命疾病。Rae等曾预测细胞质中游离铜离子水平极低，通常低到难以观测。我们近期开发了一种人源脱辅基碳酸酐酶II（hCA II）变体，用于金属离子传感，其对Cu(II)相对于Zn(II)的选择性比野生型蛋白提高25倍，从而能够在普通细胞皮摩尔游离锌存在下准确测量...