荧光生物传感器通常在亮态与暗态之间切换，暗态信噪比低，限制低浓度钙的定量测量。作者在工程化 mTurquoise 基钙传感器红移变体时，意外获得一种绿色发射传感器 G-Ca-FLITS。该传感器在钙结合态与游离态均保持高亮度，同时具有超过 1 ns 的钙依赖荧光寿命变化。在哺乳动物细胞中，其亮度与 GCaMP3 和 jGCaMP7c...
L-乳酸日益被认为是哺乳动物细胞间能量货币，但其经细胞外环境在细胞间释放与摄取的空间和时间动态仍不清楚。本文报道一种红色荧光细胞外L-乳酸遗传编码生物传感器R-eLACCO2.1。与既往绿色荧光传感器相比，R-eLACCO2.1在活体内对细胞外L-乳酸升高的敏感性和光谱正交性更优。该传感器在培养细胞、小鼠脑片和活体小鼠中均表现出良好...
本文提出一种用于全面定量自噬起始的实验方案，基于 LC3B Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器的读出。该传感器在 proLC3B 的 N 端和 C 端分别融合供体荧光蛋白 Aquamarine 和受体荧光蛋白 tdLanYFP；当 ATG4B 无活性时，proLC3B 保持完整，供体与受体距离较近而发生 FRET；A...
神经元活动伴随钾离子（K+）从胞内向胞外净流出。尽管胞外 K+ 变化已被充分描述，但由于缺乏相应探针，胞内动态研究较少。本研究表征了基于 FRET 的基因编码 K+ 生物传感器 lc-LysM GEPII 1.0 在体外原代培养神经元和活体小鼠皮层神经元中测量胞内 [K+] 变化的能力。结果显示，lc-LysM GEPII 1.0 ...
本文研究环境敏感荧光染料在荧光寿命成像显微镜（FLIM）生物传感器中的应用。作者筛选了一系列 merocyanine 染料，寻找环境诱导荧光寿命变化、光稳定性和亮度在活细胞成像波长下的最佳组合。最终构建 mero87-CBD 生物传感器，将环境敏感染料通过半胱氨酸反应性连接基共价连接至选择性结合激活态 Cdc42 的亲和试剂（WAS...
聚集诱导发光（AIE）分子已成为生物成像中分子转子的有前景替代物，但将 AIE 概念从溶液转移到生命体系仍具挑战。由于细胞高度异质且区室化，需要不同策略控制拥挤细胞环境中的自组装。本文首次报道蒽-胍衍生物（AG）在乳腺癌细胞系中形成罕见且高发射 T 型二聚体的自组装机制，作为概念验证。该过程对局部极性、粘度和/或水含量高度敏感，有望...
AKT 异常激活见于多种癌症、代谢综合征和免疫疾病，是重要治疗靶点。为在活体环境中监测 AKT 活性的时空动态，作者构建了 Akt-FRET 生物传感器小鼠，结合活体成像、图像稳定与光学窗口技术，实现对 AKT 活性的纵向评估。该小鼠利用 Eevee-Akt-FRET 传感器，当细胞内 AKT 被激活时磷酸化传感器中的 AKT 共识...
半胱氨酸残基的 S-亚硝基化是多种蛋白质动态翻译后调控和氧化还原调节的重要机制。许多荧光蛋白（FP）含有半胱氨酸，GFP 衍生荧光蛋白中两个高度保守的 Cys 残基为发色团自催化形成提供有利微环境。尽管荧光蛋白 25 年来一直是细胞生物学工具，但一氧化氮（NO）对其荧光性质的影响此前未被研究。本文考察蓝色发射荧光蛋白 mTagBFP...
亚细胞pH变化在代谢、膜运输及治疗载体释放中起关键作用。现有pH测量多依赖pH敏感荧光团的强度变化，但强度法受传感器浓度、信噪比下降和需要参考荧光团等限制，推断pH不确定度高。本文提出将pH依赖荧光寿命成像显微镜（pHLIM）与深度学习结合，用于在单个囊泡水平准确定量活细胞亚细胞pH。作者将pH敏感荧光蛋白mApple分别融合至细胞...
淀粉样蛋白β（Aβ）肽在神经元内产生，部分释放至脑实质，部分保留在胞内。由于抗Aβ抗体同时捕获Aβ及其前体蛋白APP和C99，胞内Aβ检测仍具挑战。作者此前开发了C99 720-670 FRET生物传感器用于记录γ-分泌酶活性，并建立了多重免疫染色平台，可在亚细胞分辨率下选择性检测胞内Aβ。利用这些方法，作者发现C99主要在晚期内体...
基因编码荧光生物传感器是追踪完整生物系统内化学过程的重要工具，但候选传感器的开发与优化仍受限于筛选方法的技术瓶颈。本文提出一种结合液滴微流控与自动荧光成像的高通量多参数筛选平台，可将筛选通量提高约一个数量级，并能够同时评估对比度、亲和力和特异性等多个性能指标，而非仅筛选单一特征。作者利用凝胶壳珠作为微透析室，在单个微囊中表达并检测数...
自标记蛋白标签（如 HaloTag）可将融合蛋白与合成荧光素共价结合，用于荧光显微镜成像。本文报道了 HaloTag7 的工程化变体，使其在与罗丹明类荧光素结合后表现出比 HaloTag7 更高或更低的亮度和荧光寿命。作者通过定点饱和突变筛选 HaloTag 结合位点，获得更亮的 HaloTag9 以及更暗的 HaloTag10 和...
目前最成功的基因编码钙指示剂（GECI）多采用荧光强度或比率读出。尽管钙依赖的荧光强度变化较大，但强度易受光漂白、样品移动和探针局部浓度变化影响，且 GECI 对生理 pH 变化敏感，因此难以准确定量细胞内钙浓度。本文报道一种基于荧光寿命的传感策略：钙结合诱导的构象变化直接改变循环置换绿松石荧光蛋白（cpTq2）的荧光量子产率和荧光...
黄色荧光蛋白（YFP）常作为 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器中的光学报告分子，但现有 YFP 的光稳定性不足且在酸性 pH 下荧光性能较差，限制了传感灵敏度。本文系统表征了源自 Branchiostoma lanceolatum 四聚体 LanYFP 的黄色荧光蛋白 tdLanYFP。其量子产率为 0.92，消光...
胰腺导管腺癌（PDAC）高度转移且对化疗耐药，其致密促纤维增生基质可调节肿瘤进展。本研究在小鼠和患者来源 PDAC 模型中，利用基于 FAK 的 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器进行活体荧光寿命成像显微镜（FLIM）检测，实时可视化短暂调控黏着斑激酶（FAK）所介导的双向细胞-环境信号。同时，利用 FUCCI 细胞...
在活体原生组织中评估药物反应，有助于在提高疗效的同时减少脱靶效应。本研究利用Rac1-Förster共振能量转移（FRET）生物传感器小鼠进行纵向活体成像，并结合体内光转换追踪肿瘤内细胞运动，以指导乳腺癌活体治疗排程、抑制转移进展。通过乳腺光学窗口成像，作者发现肿瘤中心与侵袭边界之间Rac1活性存在差异，且靠近活体肿瘤血管的细胞Ra...
细胞外生物分子梯度在组织发育、再生以及健康与疾病过程中日益受到重视，而细胞外钙离子浓度动态却很少被研究。本文报道了一种基于 Twitch-2B 荧光蛋白融合纤维素结合肽和胶原结合肽的低亲和力钙离子生物传感器。这些重组嵌合蛋白可结合纤维素和胶原支架，从而在活体三维组织模型中实现细胞邻近区域细胞外钙离子的支架基传感。研究发现，Twitc...
荧光寿命成像（FLIM）是一种定量且与荧光强度无关的显微方法，可用于测量细胞生物学中多种生物化学和物理性质，尤其适合通过 Förster 共振能量转移（FRET）量化细胞内蛋白-蛋白相互作用。然而，时间域 FLIM-FRET 测量动态相互作用具有挑战性，因为需要从活细胞荧光团常见的复杂衰减动力学中获得可靠参数，且要求良好的光子统计。...
本文报道利用脉冲交错激发荧光寿命成像显微镜（PIE-FLIM）在单个活细胞中同时测量两种不同基因编码生物传感器探针的活性。许多基因编码生物传感器依赖 Förster 共振能量转移（FRET）来检测目标细胞信号事件引起的构象变化，而通过荧光寿命成像（FLIM）测量供体荧光团寿命变化是量化 FRET 的稳健方法。由于复杂信号网络研究要求...
荧光寿命成像显微镜（FLIM）是测量两个荧光蛋白间 Förster 共振能量转移（FRET）的稳健工具，尤其适用于遗传编码 FRET 生物传感器，可高时空分辨率监测激酶活性等生物过程。为面向高通量筛选，作者构建了基于时间门控的 fastFLIM 显微镜，其成像与荧光寿命量化速度高于时间相关单光子计数（TCSPC），并进一步开发 96...