Protein kinase A is a functional component of focal adhesions.
局灶黏附（FA）是连接细胞外基质结合整合素与肌动蛋白细胞骨架的多蛋白复合体，并传递调控细胞黏附、细胞骨架动力学和迁移的信号。尽管FA中丝氨酸/苏氨酸磷酸化比酪氨酸磷酸化更丰富，其机制仍不清楚。蛋白激酶A（PKA）在细胞黏附和迁移中发挥重要作用，且其功能高度依赖亚细胞定位。本研究证明PKA存在于分离的FA-细胞骨架复合物中，并在活细胞...
Norepinephrine activates β
去甲肾上腺素对星形胶质细胞的代谢、神经保护和免疫调节功能具有强效影响。以往认为其作用均由质膜受体介导，但心肌细胞研究显示肾上腺素受体可定位于高尔基体和内质膜，并经转运体介导摄取进入细胞内。作者此前发现星形胶质细胞外核膜富含有机阳离子转运体3（OCT3），提示内质膜也可能发生肾上腺素能信号。本研究利用免疫荧光和Western blot...
A facile fluorescence turn-on biosensor customized for monitoring of protein kinase activity based on carboxylic carbon nanoparticle-peptide complexes.
本研究提出一种简便、低成本检测蛋白激酶A（PKA）的方法，通过将目的设计的羧基荧光素（FAM）标记肽与羧基碳纳米颗粒（CNP）组装构建荧光生物传感器。由于CNP经肽桥向FAM标记肽发生电子转移，FAM标记肽的荧光逐渐降低至低背景信号。在ATP和PKA存在下，传感器中的反应磷酸化底物肽，破坏CNP与肽之间的静电排斥力，从而改变体系光谱...
An ultrasensitive biosensor for high-resolution kinase activity imaging in awake mice.
蛋白激酶控制细胞功能的几乎所有环节，这些关键信号节点整合多条通路输入以调节复杂生理过程，异常激酶信号与多种疾病相关。虽然荧光蛋白生物传感器通过在活细胞中直接、时空精确地测量激酶活性而革新了激酶信号研究，但仍需更强健的分子工具在不同实验场景中追踪激酶活性动态。本文报道了一种经高通量连接肽库筛选获得的第二代超灵敏激发比率型蛋白激酶A（P...
Rhodopsin-mediated light-off-induced protein kinase A activation in mouse rod photoreceptor cells.
视网膜中光诱导的突触外多巴胺释放可降低视杆细胞内环磷酸腺苷（cAMP）水平，并介导光依赖性脱敏，但视杆细胞 cAMP 动态的精细时间过程因技术困难而难以解析。本研究利用表达 FRET 型蛋白激酶 A（PKA）活性生物传感器 AKAR3EV 的 PKAchu 小鼠，通过双光子活体成像观察离体视网膜中 PKA 的时空调控。除已知的开光诱...
Phase Separation of a PKA Regulatory Subunit Controls cAMP Compartmentation and Oncogenic Signaling.
细胞内信号保真度依赖于动态活性结构的组织。空间区室化曾被提出用于解释多种G蛋白偶联受体如何在共用第二信使环磷酸腺苷（cAMP）的情况下实现特异性，但限制该可扩散信使空间分布的机制长期不明。本文揭示cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）I型调节亚基RIa可随cAMP信号动态发生液-液相分离（LLPS），形成富含cAMP和PKA活性的生物分...
Functional Heterogeneity of Protein Kinase A Activation in Multipotent Stromal Cells.
多能基质细胞（MSC）表现出显著的功能异质性，但其分子机制仍不清楚。本研究利用遗传编码生物传感器 PKA-Spark，在单细胞水平探索 MSC 对激活 Gs 蛋白/环磷酸腺苷（cAMP）/蛋白激酶 A（PKA）依赖信号通路的激素的响应。PKA-Spark 在 PKA 磷酸化后形成荧光聚集体，可用于活细胞实时成像。研究首次证明，约半数...
Rational Design of a Protein Kinase A Nuclear-cytosol Translocation Reporter.
蛋白激酶A（PKA）以四聚体全酶形式存在，在 cAMP 升高时被激活，并在心脏生理、神经元发育和脂肪细胞功能等过程中发挥重要作用。尽管该激酶已被用于多种生物传感器设计，但尚未报道性能可与 Förster 共振能量转移（FRET）报告蛋白相当的单荧光团报告蛋白。本研究基于 PKA 底物识别中的静电相互作用和核定位序列（NLS）基序，设...
Booster, a Red-Shifted Genetically Encoded Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor Compatible with Cyan Fluorescent Protein/Yellow Fluorescent Protein-Based FRET Biosensors and Blue Light-Responsive Optogenetic Tools.
基于 Förster 共振能量转移（FRET）的基因编码生物传感器已被用于可视化信号分子活性。目前大多数传感器由青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白（CFP/YFP）组成，限制了在单个细胞内同时使用多种 FRET 传感器，且与蓝光驱动的光遗传工具不兼容。为克服这些问题，作者开发了具有红移激发和发射波长的 FRET 生物传感器。通过计算 För...
A label-free fluorescent biosensor for the detection of protein kinase activity based on gold nanoclusters/graphene oxide hybrid materials.
蛋白激酶A（PKA）可通过磷酸化底物肽或蛋白调控多种细胞生物过程。本文基于11-巯基十二烷酸封端金纳米簇（MUA-Au NCs）和氧化石墨烯（GO）开发了一种低背景噪声的荧光生物传感方法，用于检测PKA活性。该策略中，特殊设计的肽可通过Au-S键锚定在MUA-Au NCs表面，同时因静电作用吸附于GO表面。因此，以肽为桥，MUA-A...
DNA-hosted copper nanoclusters/graphene oxide based fluorescent biosensor for protein kinase activity detection.
本文报道了一种用于蛋白激酶A（PKA）活性检测的新型荧光生物传感器，该传感器基于双链DNA负载铜纳米簇（dsDNA-CuNCs）和氧化石墨烯（GO）。dsDNA由两条DNA链组成：一条链与另一条互补链杂交以稳定荧光CuNCs，另一条链含有ATP适配体序列。在无ATP时，dsDNA-CuNCs上的ATP适配体通过π-π堆积作用自发吸附...
Intravital microscopy of biosensor activities and intrinsic metabolic states.
体内显微镜（IVM）是一种可在活体动物组织中实时检测亚细胞信号或代谢事件的成像工具。然而，在高散射生物组织中成像时，激发光与发射光随深度增加而衰减，深度依赖性信号衰减是 IVM 的主要限制，使定量测量变得困难。因此，IVM 定量分析需要采用内部校准探针，或采用不同于强度测量的信号评估方式。本文描述了如何利用基因编码生物传感器探针的比...
A simple approach for measuring FRET in fluorescent biosensors using two-photon microscopy.
遗传编码的荧光蛋白（FP）生物传感器可用于监测活细胞和组织中的细胞事件。由于多数探针最初针对单光子激发设计，其宽双光子激发（2PE）截面和尚未充分理解的漂白特性，使双光子激光扫描显微镜（TPLSM）应用困难。本文提出一种简化FRET型荧光生物传感器在TPLSM中使用的方案。首先利用活细胞中表达的FRET标准蛋白评估并优化TPLSM系...
FRET biosensors reveal AKAP-mediated shaping of subcellular PKA activity and a novel mode of Ca(2+)/PKA crosstalk.
支架蛋白通过锚定信号酶至下游效应器附近维持细胞稳态，部分支架蛋白还可形成动态信号体并在刺激后转运至不同亚细胞区室。Gravin（AKAP12）是一种多价支架蛋白，基础条件下将蛋白激酶A（PKA）等酶锚定于质膜，细胞内钙升高时快速重分布至胞质。由于gravin重分布会影响PKA定位，作者假设gravin作为钙“开关”调节质膜处PKA与...
The stellate vascular smooth muscle cell phenotype is induced by IL-1β via the secretion of PGE2 and subsequent cAMP-dependent protein kinase A activation.
动脉粥样硬化发展与内膜细胞形态变化相关，可导致血管平滑肌细胞（VSMCs）出现星状细胞表型。本研究旨在确定动脉粥样硬化斑块中关键促动脉粥样硬化细胞因子（IL-1β、TNFα 和 IFNγ）是否能诱导该表型，因为这些分子已知可触发 VSMCs 转分化。结果显示，在所测试的主要炎症介质中，只有 IL-1β 能在 VSMCs 中诱导星状形...
A practical method for monitoring FRET-based biosensors in living animals using two-photon microscopy.
多光子显微镜系统的商业化推动了活体显微镜在完整动物细胞生物学研究中的应用，而基于荧光蛋白（FP）的生物传感器可实时监测多种细胞过程。Förster 共振能量转移（FRET）探针是检测细胞事件最灵敏的指标之一，但双光子激发（2PE）与单光子激发的差异使活体 2PE FRET 测量仍具挑战。本文提出一种简化 FRET 生物传感器用于活体...
The spatio-temporal dynamics of PKA activity profile during mitosis and its correlation to chromosome segregation.
蛋白激酶A（PKA）调控细胞周期等多种细胞过程。本研究利用遗传编码的FRET生物传感器，基于AKAR衍生的AKAREV探针，在活HeLa细胞中以单细胞水平表征有丝分裂过程中PKA活性。结果显示，HeLa细胞进入中期后PKA活性显著升高，并维持至胞质分裂/末期结束。采用AKAREV T>A失活突变体和H89抑制剂验证了所测PKA活性的...
The regulation of β-adrenergic receptor-mediated PKA activation by substrate stiffness via microtubule dynamics in human MSCs.
细胞机械微环境对细胞功能具有重要影响，基质刚度可指导干细胞分化，但其机制尚不清楚。本文报道，在人源间充质干细胞（HMSCs）中，基质刚度可调节细胞对β-肾上腺素受体（β-AR）激动剂异丙肾上腺素（ISO）的反应。基于荧光共振能量转移（FRET）的A激酶活性报告蛋白（AKAR2）显示，软基质上ISO诱导的蛋白激酶A（PKA）活性较低，...
Biosensor imaging in brain slice preparations.
蛋白激酶A（PKA）广泛存在于动物界，在神经系统中作为激酶效应器整合多种神经调质的细胞效应。近年来发展的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，如AKAR，使活细胞中PKA激活的直接测量成为可能：只需在CFP激发下测量CFP与YFP发射波长的荧光比值。该方法可在细胞甚至亚细胞水平提供秒级时间分辨率的数据，为理解时空信号整合开辟新途径...
Peptide-templated gold nanocluster beacon as a sensitive, label-free sensor for protein post-translational modification enzymes.
蛋白翻译后修饰（PTMs）多由酶调控，在功能蛋白质组学中起关键作用，因此检测PTM酶对细胞功能研究和诊断治疗工具开发至关重要。本文发展了一种简单的肽模板法，快速合成高荧光金纳米团簇（AuNCs），并研究酶促修饰对其发光的影响。研究发现，酶可对肽模板AuNCs进行化学修饰并猝灭其荧光，从而建立实时、无标记的PTM酶传感策略。以组蛋白去...