Simultaneous detection of membrane contact dynamics and associated Ca
膜接触位点（MCSs）是细胞器协调功能的纳米级界面，但其动态性和微小尺寸使现有成像技术难以解析。作者设计了一系列可逆化学遗传报告分子，采用改进的低亲和力 splitFAST/RspA-splitFAST 变体，在体外和体内以高时空分辨率研究不同 MCS 的动态。这些探针可检测内质网-线粒体、内质网-质膜和质膜-线粒体接触，能追踪融合...
Fast and Artifact-Free Excitation Multiplexing Using Synchronized Image Scanning.
多色荧光显微镜是生命科学和材料科学中观察结构与动态的重要工具。然而，对激发光谱不同的荧光标记进行近同时采集较为困难，常规顺序成像易产生时间混叠伪影。本文提出一种简单策略，利用光学元件使样品图像在相机传感器上以远高于图像采集速率的速度位移，并与照明同步，从而实现多个激发波长下的准同时荧光成像。不同激发波长诱发的发射可被编码到点扩散函数...
Development of an miRFP680-Based Fluorescent Calcium Ion Biosensor Using End-Optimized Transposons.
开发新的或改进的单荧光蛋白生物传感器（SFPB），尤其近红外激发/发射，对生物成像很重要。为加速 SFPB 开发，作者报道末端优化的修饰转座子，用于将荧光蛋白随机插入分析物结合域或反之，以最小化连接 linker 长度。较短 linker 可增强结合域构象变化向荧光蛋白发色团荧光调制的变构耦合。概念验证中，末端修饰 Mu 转座子将环...
FRET-Based Ca
荧光共振能量转移（FRET）生物传感器能够以高时间分辨率动态可视化活细胞中的分子事件。具有光谱可区分荧光蛋白对的FRET传感器可在双FRET活细胞成像中提供清晰对比。本文开发了一种基于EGFP和FusionRed荧光蛋白的新型FRET钙离子生物传感器（FRET-GFPRed）。通过不同滤光片设置，该传感器可与典型ECFP/YPet ...
Circularly Permuted Fluorogenic Proteins for the Design of Modular Biosensors.
荧光报告分子是设计光学生物传感器以在活细胞中成像胞内分析物的关键元件。本文报道了荧光激活与吸收位移标签（FAST）的循环置换变体（cpFAST）的开发，并展示其作为生物传感器报告模块的潜力。cpFAST变体通过将荧光配体（fluorogen）的结合与激活（从而产生荧光）与特定分析物识别偶联，使荧光响应依赖于分析物结合。作者将其与钙结...
Genetically encoded calcium indicators for fluorescence imaging in the moss Physcomitrella: GCaMP3 provides a bright new look.
本文报道了在苔藓 Physcomitrella patens 中构建并验证遗传编码钙指示剂（GECI）用于活细胞 Ca2+ 荧光成像的方法。作者通过基因枪将 YC3.6 和 GCaMP3 表达载体导入原丝体细胞，分别由玉米 Ubiquitin1 启动子驱动；GCaMP3 株系同时表达红色荧光蛋白 RFP 作为内参。在 NaCl 盐胁...
Ratiometric biosensors based on dimerization-dependent fluorescent protein exchange.
本文报道了一类基于二聚化依赖荧光蛋白（ddFP）异二聚体伙伴可逆交换的遗传编码荧光生物传感器。ddFP由含色团的A拷贝（绿色GA或红色RA）和不形成色团但可显著增强A拷贝荧光的B拷贝组成；GA与RA均可与互补B拷贝结合形成荧光异二聚体。作者利用B拷贝在GA与RA之间的竞争性交换，使蛋白酶切割、Ca2+结合、PIP2水解、cAMP/P...
Excited state structural events of a dual-emission fluorescent protein biosensor for Ca²⁺ imaging studied by femtosecond stimulated Raman spectroscopy.
荧光蛋白（FPs）是一类受光激发后发出特征颜色荧光的发光生物分子。钙调蛋白（CaM）-绿色荧光蛋白（GFP）嵌合体已被用于光学检测钙离子（Ca2+）。本研究采用飞秒受激拉曼光谱（FSRS）考察一种遗传编码钙离子光学成像生物传感器 GEM-GECO1；该传感器在无 Ca2+ 时发绿光，结合 Ca2+ 后发蓝光。时间分辨 FSRS 数据...
Confocal FLIM of genetically encoded FRET sensors for quantitative Ca2+ imaging.
荧光寿命成像（FLIM）是一种可与共聚焦成像结合的强有力成像模式。基于分子内 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器中，供体荧光衰减时间的变化可提供内在定量信息。本文描述了一种用于定量钙离子（Ca2+）成像的共聚焦 FLIM 方案，采用以肌钙蛋白 C 为 Ca2+ 感应单元的基因编码 FRET 钙传感器 TN-XL，并...
Ca(2+) signaling in arterioles and small arteries of conscious, restrained, optical biosensor mice.
本研究利用双光子荧光显微镜和有意识固定光学生物传感器小鼠，原位检测小鼠耳部小动脉平滑肌细胞内钙离子（[Ca2+]i）。ExMLCK 小鼠在平滑肌中表达遗传编码 FRET 钙指示剂 exMLCK，并植入血压遥测装置以维持正常平均动脉压（MAP）和交感神经活动（SNA）。固定后有意识小鼠 MAP 为 101±4 mmHg，与自由活动 1...
GAP, an aequorin-based fluorescent indicator for imaging Ca2+ in organelles.
基因编码钙指示剂可用于监测细胞器内亚细胞 Ca2+ 信号。多数基因编码钙指示剂由内源性钙结合蛋白融合而成，其在体内的功能可能因与细胞伙伴竞争而受干扰。本文报道了一类基于两种 Aequorea victoria 蛋白——GFP 与 apo-aequorin 融合的新型荧光 Ca2+ 传感器，命名为 GAP。GAP 具有独特组合特性：双...
Imaging changes in cytoplasmic calcium using the Yellow Cameleon 3.6 biosensor and confocal microscopy.
细胞质钙离子浓度（[Ca2+]cyt）的变化是植物多种细胞信号转导通路的核心调控事件，也参与许多脂质介导的调控网络。由于钙信号在植物生长和环境响应中的关键作用，监测其时空动态对于理解细胞生理至关重要。本文描述了利用稳定表达黄色变色龙3.6（YC3.6）的拟南芥根细胞测量细胞质钙离子浓度的方法。YC3.6是一种钙离子敏感型荧光蛋白生物...
A fluorogenic red fluorescent protein heterodimer.
基于水母绿色荧光蛋白（GFP）变体的基因编码生物传感器已能成像多种细胞内生化过程，但红色荧光蛋白（RFP）基传感器仍较少。为便于在单细胞中同时成像多种生物传感器，作者开发了一种二聚化依赖型红色荧光蛋白（ddRFP）策略。通过理性工程与定向蛋白进化，获得由A1和B1组成的低亲和力异源二聚体，其解离常数Kd为33 μM，形成异源二聚体后...
Design of fluorescent fusion protein probes.
许多荧光探针依赖荧光蛋白对之间的荧光共振能量转移（FRET）来报告细胞事件。当融合传感蛋白响应细胞事件发生构象变化时，供体与受体之间的能量转移效率随之改变，因此可通过FRET效率变化关联目标分子或细胞过程。本文介绍基于结构的计算设计策略：利用候选FRET生物传感器各结构域的三维结构，对柔性连接区进行构象采样，并预测距离因子、取向因子...