Biosensors design in yeast and applications in metabolic engineering.
微生物细胞工厂可持续生产化学品、燃料和药物，但高通量检测产物合成仍费时费力，因为产物合成常无明确表型，传统分析难以快速评价菌株。遗传编码生物传感器可感知代谢物并将检测与执行器偶联，实现单细胞水平快速检测小分子，是高通量分析的有前景工具。本文综述酿酒酵母中生物传感器设计与工程化进展及其在代谢工程中的应用，介绍转录因子型、RNA型和酶耦...
Identification of Celastrol as a Novel YAP-TEAD Inhibitor for Cancer Therapy by High Throughput Screening with Ultrasensitive
Hippo通路是调控多种生物学功能的关键信号通路，其失调常见于多种癌症。破坏Hippo核心组分YAP及其同源物TAZ与转录因子TEAD的相互作用，被认为是抑制YAP/TAZ致癌转录输出的潜在治疗策略，但目前尚无临床可用药物。为筛选能阻断YAP–TEAD相互作用的小分子，作者开发了首个超亮NanoLuc生物发光生物传感器，将SmBiT...
Design and Characterization of Biosensors for the Screening of Modular Assembled Naringenin Biosynthetic Library in
在重组宿主中组装和优化植物天然产物合成途径时，鉴定可获得最佳生产滴度的基因直系同源物是常见挑战。本文报道了在酿酒酵母中模块化组装柚皮素合成途径，并利用优化的柚皮素诱导型原核转录激活因子作为生物传感器进行高通量筛选。作者通过 Golden Gate 组合克隆将柚皮素合成基因与不同强度启动子组合，构建了覆盖约972种组合的酿酒酵母菌株库...
FadR-Based Biosensor-Assisted Screening for Genes Enhancing Fatty Acyl-CoA Pools in
脂肪酸衍生物在化学构建块到生物燃料等工业领域应用广泛。由于脂肪酸代谢高度动态，难以通过理性方法鉴定调节脂肪酸酰-CoA水平的基因。代谢物生物传感器可用于在体内以高通量方式筛选大规模基因库。本文在酿酒酵母中建立了基于大肠杆菌转录因子 FadR 的脂肪酸酰-CoA传感器，并与基因过表达库结合，筛选提高脂肪酸酰-CoA池的基因。经流式细胞...
Displaced by Deceivers: Prevention of Biosensor Cross-Talk Is Pivotal for Successful Biosensor-Based High-Throughput Screening Campaigns.
转录生物传感器将难以直接观察的生产表型与荧光等易测输出信号相联系，已成为蛋白质和菌株工程中的有力工具；与荧光激活细胞分选（FACS）联用后，可对大规模突变库进行高通量筛选。然而，尽管已有大量文献报道转录生物传感器的构建与表征，真正成功用于此类高通量筛选的研究仍很少。本文报道了面向大肠杆菌的反式肉桂酸响应型转录生物传感器 pSenCA...
Identification of a New Inhibitor That Stabilizes Interleukin-2-Inducible T-Cell Kinase in Its Inactive Conformation.
白细胞介素-2诱导性T细胞激酶（ITK）在T细胞信号转导中发挥重要作用，是潜在药物靶点。由于蛋白激酶ATP结合位点高度保守，设计选择性激酶抑制剂仍具挑战。靶向激酶非活性构象有助于提高抑制剂选择性，因此从初筛命中物中识别能稳定非活性构象的化合物对选择性评估很重要。本研究使用去磷酸化ITK，通过ADP-Glo酶活检测对39万化合物库进行...
Synthetic Gene Circuits Enable Systems-Level Biosensor Trigger Discovery at the Host-Microbe Interface.
将合成基因电路导入肠道细菌以感知、记录并响应体内信号，是诊断、治疗和预防疾病的新策略。然而，疾病响应电路的设计受限于已知生物传感器数量有限。本研究在大肠杆菌中应用稳健的遗传记忆电路，在健康与疾病哺乳动物肠道中鉴定新的细菌生物传感器触发器，用于构建诊断或治疗电路。作者建立了基于高通量文库构建、筛选、二代测序和计算分析的系统级流程，能够...
Nanotoxicity assessment: A challenging application for cutting edge electroanalytical tools.
近年来，含工程纳米材料（ENMs）的商业产品数量呈指数增长，因此必须系统评估其对生态系统和人体健康的毒性。纳米毒理学作为评估 ENMs 危害的交叉学科迅速发展，已有多种物理化学与生化方法用于从毒理学角度表征纳米材料。电分析与生物电化学方法可拓展纳米毒性评估技术体系，并加速 ENMs 毒性效应的检测与筛选。这些方法可在单细胞、细胞群体...
Temporal Metabolite, Ion, and Enzyme Activity Profiling Using Fluorescence Microscopy and Genetically Encoded Biosensors.
活细胞利用复杂且高度动态的信号网络和转录回路维持稳态，并响应不断变化的环境。这些网络使细胞能够严格控制离子、代谢物、蛋白质及其他生物大分子的胞内浓度，并在能量需求与生长所需分解代谢之间保持平衡。由于这些网络相互关联，且细胞系统对外部环境极为敏感，阐明遗传和药理扰动的分子机制仍具挑战性。活细胞成像结合遗传编码荧光生物传感器，为在细胞、...
Synthetic biology for evolutionary engineering: from perturbation of genotype to acquisition of desired phenotype.
随着生物基产业受到关注，快速有效改良菌株的技术需求显著增加。进化工程对生物学信息依赖较低，已被用于菌株改良。近年来，合成生物学在进化工程中取得重要进展，尤其发展了用于表型扰动的合成工具；同时，发现具有调控功能的生物部件并设计新型遗传回路，也推动了高通量筛选与选择。本综述首先简述用于诱变和筛选改良变体的合成生物学工具基础，随后描述这些...
Artificial Caprolactam-Specific Riboswitch as an Intracellular Metabolite Sensor.
己内酰胺是合成尼龙-6的单体，近期已开发用于生物基生产尼龙-6的重组微生物菌株。胞内己内酰胺生物传感器可促进重组微生物菌株的高通量代谢工程。由于重组菌株会混合生产己内酰胺和戊内酰胺，己内酰胺传感器必须对己内酰胺具有高特异性，但此前尚未报道高特异性己内酰胺传感器。本文开发了一种特异性响应己内酰胺的人工核糖开关。该核糖开关采用体外-体内...
Syntrophic co-culture amplification of production phenotype for high-throughput screening of microbial strain libraries.
微生物可被工程化合成多种生物产品，但生产表型评价仍是设计-构建-测试循环中的常见瓶颈，菌株开发需要反复构建和测试文库。本文提出共生共培养放大生产表型（SnoCAP）方法。通过代谢交叉喂养回路，将目标分子产量转化为高度可区分的共培养生长特性，从而放大产量差异并转化为明显生长表型。作者以大肠杆菌为模型，分别筛选2-酮异戊酸（异丁醇前体）...
Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors.
人乳寡糖（HMOs）是人乳中具有重要婴儿健康益处的复杂碳水化合物，但其生物合成优化受限于单糖和糖苷键检测通量低。传统色谱/质谱方法通量通常仅为每天数百样品且难以自动化。本文报道一种遗传编码细菌全细胞生物传感器，通过异源表达岩藻糖苷酶实现岩藻糖基化 HMO 结构 2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）和 3-岩藻糖基乳糖（3-FL）的高通量...
Sensor-Enabled Alleviation of Product Inhibition in Chorismate Pyruvate-Lyase.
产物抑制是工业酶应用中的常见瓶颈，传统方法需对大量突变体在多种底物和产物浓度下进行体外测试，且结果可能与全细胞代谢环境不一致。本研究针对工业相关酶莽草酸丙酮酸裂解酶（UbiC）建立了一种高通量体内筛选方法，以缓解其产物抑制。作者首先在工业宿主假单胞菌 Pseudomonas putida KT2440 中工程化了一个高特异性、遗传编...
Biosensor-guided improvements in salicylate production by recombinant Escherichia coli.
水杨酸可由常见代谢中间体莽草酸生物合成，并应用于制药和生物塑料工业。虽然针对莽草酸通路的代谢工程已实现多种芳香化合物合成，但通路组分相对表达水平如何影响水杨酸产量仍不清楚，且某些可提高产量的宿主基因缺失难以预测。本研究利用水杨酸响应型转录因子优化重组大肠杆菌中莽草酸/水杨酸通路基因的表达水平，并筛选染色体转座子插入库以提高水杨酸产量...
Development of Highly Sensitive Biosensors of RAF Dimerization in Cells.
RAF 激酶是 RAS-RAF-MEK-ERK 信号通路的关键组分，BRAF 突变黑色素瘤患者使用 dabrafenib 和 vemurafenib 等抑制剂可获得显著疗效，但长期用药可出现耐药、肿瘤复发及皮肤鳞状细胞癌等不良反应，部分机制与抑制剂诱导的 RAF 二聚化及 ERK 悖论激活有关。本文利用分裂增强叩甲荧光素酶（Emer...
A Regulatory NADH/NAD+ Redox Biosensor for Bacteria.
NADH与NAD+是驱动数百种生化反应的关键辅因子，其比值是反映细胞代谢状态的重要标志。传统方法测定NADH/NAD+比值操作繁琐、易产生误差，且不适合高通量筛选。本文报道了一种基于氧化还原响应型细菌转录因子Rex的遗传编码比率型NADH/NAD+生物传感器。作者将枯草芽孢杆菌Rex（B-Rex）移植到大肠杆菌中，并通过调节B-Re...
Monitoring activities of receptor tyrosine kinases using a universal adapter in genetically encoded split TEV assays.
受体酪氨酸激酶（RTKs）在细胞间通讯、增殖分化、存活和组织稳态等细胞生物学过程中发挥关键作用，并与癌症和神经发育障碍等疾病相关。配体激活的 RTK 通过 RTK 上的磷酸酪氨酸（p-Tyr）基序和适配体蛋白中的磷酸酪氨酸结合域（如 SH2 域）招募适配体蛋白。由于 RTK/适配体组合众多，标准化比较受体活性具有挑战。本文在细胞实验...
Development of a Synthetic 3-Dehydroshikimate Biosensor in Escherichia coli for Metabolite Monitoring and Genetic Screening.
针对目标代谢物的生物传感器可为代谢工程提供高通量筛选工具，但已充分表征的代谢物感知模块往往缺乏，限制了稳健生物传感器的快速开发。本研究提出转录组辅助代谢物感知（TAMES）策略，通过比较目标代谢物产生株与非产生株的选择性转录组分析，并结合定量逆转录 PCR（RT-qPCR）验证，筛选响应目标代谢物的感知模块。将该策略应用于 3-脱氢...
Development of a novel, sensitive cell-based corin assay.
Corin（心房利钠肽转化酶，EC 3.4.21）是表达于心肌细胞的跨膜丝氨酸蛋白酶，通过切割并激活前心房利钠肽（pro-ANP）生成有生物活性的 ANP，发挥心脏保护作用。作者此前建立了稳定表达 ANP 受体、cGMP 依赖性阳离子通道和钙敏感发光蛋白 aequorin 的 ANP 报告细胞系，用于实时检测 cGMP。本文报道了用...