Rac小G蛋白家族具有多种调控因子，可将胞外信号整合为紧密的时空活性图谱，从而促进特定细胞形态与反应。本研究构建了一种Rac-FRET小鼠品系，使其普遍表达Raichu-Rac生物传感器，从而能够在活体组织和原代细胞中进行FRET成像与Rac活性定量，而不影响细胞特性与反应。我们评估了趋化性Rac-FRET中性粒细胞中的Rac活性，...
Cdc42 是动态肌动蛋白组织的关键调控因子，但其在分化上皮中如何影响稳态肌动蛋白结构仍不清楚。作者利用内耳毛细胞特异性条件敲除小鼠，分析 Cdc42 在具有稳定肌动蛋白突起（静纤毛）的毛细胞中的作用。Atoh1-Cre;Cdc42flox/flox 小鼠毛细胞发育正常，但成熟后逐渐退化，导致进行性高频听力下降。耳蜗毛细胞退化在内毛...
本文提出一种基于波动分析的成像方法，用于定量研究蛋白寡聚化如何调节多功能蛋白的信号活性。作者以 Rac1 FRET 生物传感器为对象，在活细胞中记录荧光寿命成像（FLIM）数据，并使同一数据格式同时支持相位（phasor）分析与交叉 Number and Brightness（cN&B）分析。通过该方法，可测量 Rac1 传感器在细...
星形胶质细胞形态可能受cAMP调节，并影响其与突触的结构关联。β-肾上腺素能受体（β-AR）可升高胞内cAMP浓度（[cAMP]i），但单活星形胶质细胞中β-AR介导cAMP信号的实时动态及其形态效应尚未研究。作者使用FRET cAMP生物传感器Epac1-camps，实时监测原代大鼠星形胶质细胞中[cAMP]i变化，并用共聚焦显微...
在生物传感器中，遗传编码的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器被广泛用于在活细胞或组织中定位并测量酶活性。激酶活性尤其重要，因为其时空调控对理解细胞命运决定至关重要；ERK 是信号转导通路中的关键节点，可引导细胞进入不同生理过程。为在体内分析激酶并检测其活性的细微变化，需要更好的工具。本文报道了对先前 ERK 活性报告分子 EKA...
有丝分裂自19世纪80年代早期即作为细胞周期关键事件被研究，期间细胞结构发生显著变化，最终使复制后的染色体均等分配到两个子细胞。目前已有对这一复杂且高度有序细胞事件的详细描述。进入有丝分裂、核膜崩解、微管（MT）纺锤体形成、染色体附着，以及有丝分裂退出和胞质分裂等关键步骤中的许多调控因子也已被鉴定。然而，理解每个调控因子在细胞重排过...
近期证据表明，内皮集落形成细胞（ECFCs）可作为改善血管损伤受试者血管形成的细胞治疗手段，主要源于其强血管生成潜力。Rho家族GTP酶Cdc42在该血管生成过程中起主要作用，但细胞外基质（ECM）刚度如何影响ECFC早期空泡形成过程中的Cdc42活性仍不清楚。本研究使用基于荧光共振能量转移（FRET）的Cdc42生物传感器，考察三...
细胞死亡对维持内稳态至关重要，程序性细胞死亡异常与多种疾病相关。程序性细胞死亡最初主要指凋亡，现已扩展至新近阐明的坏死性凋亡。为研究细胞死亡信号及其分子机制，研究者发展了多种生化与荧光检测方法。本文首先概述程序性细胞死亡的主要类型及动态研究的重要性，随后系统综述凋亡与坏死性凋亡的信号通路及检测策略，重点介绍荧光探针、报告蛋白和基于 ...
本研究开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的新型σ1受体（σ1R）生物传感器，用于在活细胞中实时监测σ1R配体诱导的构象变化。作者将青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）分别融合到σ1R的N端和C端，构建σ1RCFP/YFP融合蛋白，并稳定表达于HEK-293T细胞。通过436 nm激发并同步检测480 nm和535 ...
氧化磷酸化（OXPHOS）系统产生呼吸细胞中大部分三磷酸腺苷（ATP）。缺氧等导致ATP耗竭的刺激会触发促进ATP生成的适应性反应，但缺氧早期OXPHOS如何被调控仍不清楚。本研究通过选择性测量线粒体基质内ATP水平，鉴定缺氧诱导蛋白G0/G1转换基因2（G0s2）为OXPHOS的正调控因子。作者利用线粒体靶向的FRET型ATP生物...
本研究开发了一种基因编码的Förster共振能量转移（FRET）生物传感器，用于连续监测基质金属蛋白酶9（MMP-9）的蛋白水解活性。MMP-9是一种胞外分泌型内肽酶，在发育、学习与记忆、癌症转移和卒中等过程中发挥重要作用。要评估该蛋白酶的功能，必须精确测定其活性动力学和亚细胞定位。该传感器无毒，并通过血小板源性生长因子受体跨膜域锚...
基于荧光蛋白（FP）的生物传感器可实时监测活细胞内酶活性，但第一代 FRET 型激酶传感器通常荧光响应较低，优化过程费时费力。本文报道利用高通量大肠杆菌菌落筛选策略优化激酶 FRET 生物传感器。作者构建 pUADE 双表达质粒，在 Ptac 启动子下表达传感器变体，在 PBAD 启动子下表达组成型激酶；通过 L-阿拉伯糖诱导激酶表...
出生后脑室-室管膜下区（V-SVZ）产生的新生神经元通过称为“链迁移”的集体细胞迁移过程向嗅球迁移。这些新生神经元的胞体呈跳跃式运动，提示每个神经元在迁移过程中会经历“静止”期。本研究利用出生后小鼠脑探讨静止神经元在链迁移中的作用，发现静止神经元发生动态形态改变，其胞体形成深凹陷。抑制 Rac1 活性使活体新生神经元凹陷减少。利用 ...
群体感应（QS）参与发光、抗生素产生和生物膜形成等重要生物学过程。自诱导物N-(3-氧代己酰基)-L-高丝氨酸内酯（3OC6HSL）在费氏弧菌（Vibrio fischeri）的QS系统中起关键作用，实时追踪3OC6HSL对研究QS信号转导具有重要意义。传统检测主要依赖细菌报告菌株和高性能液相色谱（HPLC），存在耗时长、灵敏度低等...
蛋白激酶A（PKA）广泛存在于动物界，在神经系统中作为激酶效应器整合多种神经调质的细胞效应。近年来发展的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，如AKAR，使活细胞中PKA激活的直接测量成为可能：只需在CFP激发下测量CFP与YFP发射波长的荧光比值。该方法可在细胞甚至亚细胞水平提供秒级时间分辨率的数据，为理解时空信号整合开辟新途径...
本章首先简要介绍荧光与荧光共振能量转移（FRET）的基本原理，随后重点讨论记录FRET最常用的方法，尤其关注广泛用于生物传感器成像的显微镜技术。文中比较了宽场荧光显微镜与激光扫描共聚焦显微镜的仪器选择，说明基于强度（如比率成像、受体光漂白）和基于供体荧光寿命（FLIM）的FRET检测方式，并给出将特定记录方法与具体科学实验相匹配的指...
正确纺锤体组装和染色体分离依赖精确的微管动态，部分由kinesin-13 MCAK调控。Aurora B依赖磷酸化可抑制MCAK的微管去聚合活性，但机制不明。本文开发了首个用于MCAK的FRET生物传感器，显示溶液中MCAK通过C端结构域（CT）与neck相互作用而处于闭合构象。荧光寿命成像（FLIM）表明，结合微管末端的MCAK相...
本论文报道了一种用于在单细胞内直接监测驱动蛋白-2家族马达KIF17活性的FRET生物传感器。KIF17通过调节微管动态和组织促进上皮分化，但其活性如何受时空调控尚不清楚。多种驱动蛋白包括KIF17可采取紧凑和伸展构象，分别对应自抑制和活性状态。作者构建了全长KIF17两端分别融合mCherry和Emerald GFP的表达载体，利...
细胞外调节激酶ERK在细胞生长信号级联中起核心作用。本文利用基于荧光共振能量转移（FRET）的ERK生物传感器EKAREV，在活细胞中长时间监测ERK活性，发现ERK活性以随机脉冲形式自发出现，并可在邻近细胞间传播。在正常大鼠肾上皮细胞NRK-52E中，ERK脉冲频率随细胞密度呈钟形变化，在中等密度时最高，而脉冲幅度基本不变；脉冲频...
近年来，荧光成像因荧光蛋白和荧光染料日益丰富而受到特别关注，并推动了新型生物传感器的发展。基于 Förster 共振能量转移（FRET）原理的基因编码生物传感器已广泛用于生物学中，以可视化信号分子的时空动态。尽管此类生物传感器数量不断增加，但由于 FRET 生物传感器稳定表达困难，其应用大多局限于瞬时表达生物传感器的培养细胞。本研究...