基因编码的比率型荧光生物传感器可用于在活细胞中定量测量细胞内离子浓度。本文讨论选择钙离子（Ca2+）或锌离子（Zn2+）生物传感器时需要考虑的重要因素，包括传感器的表观解离常数（Kd′）、动态范围、信噪比、亚细胞定位、pH、氧化还原状态、盐浓度以及离子结合/解离速率等。作者还分析了使用此类传感器进行定量测量的限制，并解释同一传感器在...
本章首先简要介绍荧光与荧光共振能量转移（FRET）的基本原理，随后重点讨论记录FRET最常用的方法，尤其关注广泛用于生物传感器成像的显微镜技术。文中比较了宽场荧光显微镜与激光扫描共聚焦显微镜的仪器选择，说明基于强度（如比率成像、受体光漂白）和基于供体荧光寿命（FLIM）的FRET检测方式，并给出将特定记录方法与具体科学实验相匹配的指...
蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是细胞信号网络中几乎所有动态过程的关键机制。基于荧光蛋白（FPs）的遗传编码报告分子是时空可视化细胞参数的有力工具。因此，常用模块化生物传感器设计已被改造，用于生成多种蛋白基指示器，以监测活细胞中不同 PTM 或相应酶活性，为单个 PTM 的动力学与调控功能提供新的生物学认识。本综述描述聚焦 PTM 的...
ATP:ADP 比值是细胞能量状态的核心参数，决定 ATP 水解自由能变化并调控多种代谢活动。本文报道了一种经优化的遗传编码荧光生物传感器 PercevalHR，用于感知胞内 ATP:ADP 比值。PercevalHR 的响应范围被调谐至哺乳动物细胞预期的胞内 ATP:ADP 水平，并可在活样本中用于单光子或双光子显微镜成像。作者利...
本研究采用比率型基因编码氧化还原敏感绿色荧光蛋白与人谷胱甘肽过氧化物酶/还原酶（glutaredoxin 1, Grx1）融合探针 Grx1-roGFP2，实时监测哺乳动物细胞胞质谷胱甘肽氧化还原电位。该探针可检测由短波长激发触发的、依赖培养基的胞质氧化。当活细胞时间序列成像的采集间隔小于 30 s 时，可揭示光诱导氧化的瞬时性质。...
细胞信号网络在环境刺激下被激活，其特异性取决于下游通路在时间和空间上的动态整合。为解析单一信号通路的动态调控，研究者开发了多种活细胞生物传感器。生物发光共振能量转移（BRET）技术因无需荧光激发、信噪比高，特别适合监测活细胞中的蛋白互作或构象变化。细胞外调节激酶（ERK）广泛表达并参与增殖、分化、神经可塑性、存活和凋亡等多种功能，其...
一氧化氮（NO）和过氧化氢（H2O2）均在心肌细胞内合成，并参与心血管反应调控，但二者在心肌细胞信号中的相互关系尚不清楚。成年小鼠心肌细胞是研究活性氧与活性氮受体调控信号的重要模型，但培养存活时间短且蛋白量有限。本文利用化学传感器和生物传感器开展成年心肌细胞内 H2O2 与 NO 的活体成像研究，详细描述了适合成像的心肌细胞分离与培...
在哺乳动物细胞中实时、非侵入地成像胞内第二信使，同时保持其体内表型，需要结构精密的生物传感器。本文提供了在主动脉血管平滑肌细胞中使用单波长cGMP生物传感器δ-FlincG的方法学。δ-FlincG由含两个cGMP结合域的蛋白激酶GIα（PKGIα）调节域片段与环状置换EGFP（cpEGFP）融合而成，cGMP结合引起荧光强度变化，...
活性氧（ROS）参与心血管、炎症、退行性疾病、衰老、肌营养不良和肌肉疲劳等多种病理过程。NADPH 氧化酶（Nox）是氧化还原信号中重要的 ROS 来源，但现有工具难以在活细胞中提供足够的空间分辨率和特异性。作者将氧化还原敏感绿色荧光蛋白 roGFP 与 Nox 组织蛋白 p47phox 融合，构建了可特异性评估 Nox 活性的氧化...
肝素结合表皮生长因子样生长因子（HB-EGF）是表皮生长因子（EGF）家族成员，以Ⅰ型跨膜前体 proHB-EGF 形式合成，其膜近端结构域可被解整合素和基质金属蛋白酶（ADAM）切割，使 HB-EGF 释放至胞外并强烈激活 EGF 受体。proHB-EGF 脱落与多种细胞的增殖、分化和存活密切相关，但传统碱性磷酸酶标记法或 Wes...
许多癌症存在蛋白激酶活性失调，但并非都对抑制剂敏感，部分原因在于复杂组织中磷酸化动态尚不清楚。活细胞亚细胞分析可揭示混合细胞群体中激酶信号细节。现有原位激酶活性成像工具多依赖荧光强度或 Förster 共振能量转移（FRET），易受光谱串扰和光漂白影响。本文报道一种基于荧光寿命成像显微镜（FLIM）的细胞穿透肽生物传感器，用于动态监...
基于环境敏感染料的荧光生物传感器可在活细胞内实现内源蛋白激活的可视化与定量。紫精（merocyanine）染料因亮度高、激发与发射波长长，并能随微环境变化产生明显荧光响应，而特别适合活细胞成像。本文通过5种给体杂环与5种受体杂环的组合反应，系统合成了25种紫精染料，考察结构特征对染料亮度、环境响应性和光稳定性的影响。其中4种染料表现...
全面理解细胞信号转导需要准确测量分子通路中的信息流。过去，信息流主要依据遗传或蛋白-蛋白相互作用推断，但这些方法通常对细胞群体平均，难以捕捉仅在特定亚细胞区域短暂激活的信号通路。单细胞信号状态数据正在出现，但多为特定时间点快照或整细胞平均。蛋白活性生物传感器可在活细胞中测量信号分子的时空激活，其数据包含复杂动态信息，可沿时间和空间解...
本文提出一种基于波动分析的 FRET 生物传感器检测方法，用于在活细胞中同时测量蛋白质的分子流与信号活性。作者将荧光寿命成像显微镜（FLIM）的相量（phasor）分析与沿毫秒级线扫描获取的交叉对关联函数（cross-pCF）分析相结合，检测 Rho GTPase 活性（即 FRET 生物传感器信号）的空间定位，并解析该活性群体所采...
蛋白激酶是调控几乎所有生物过程的关键酶类，其结构折叠相似，但作用机制、调控方式、底物特异性和亚细胞定位差异显著。传统放射性终点检测无法在天然环境中实时表征其动态活性。荧光生物传感器的发展为在活细胞中实时、高时空分辨率地研究蛋白激酶行为与调控提供了新途径。目前已发展两大类传感器：一类是遗传编码的单链荧光共振能量转移（FRET）生物传感...
青色荧光蛋白（CFP）常作为遗传编码生物传感器中的FRET供体用于活细胞成像。近期通过大规模随机突变获得了量子产率显著提高的CFP变体。本文表明，仅在ECFP中引入T65S和H148G两个突变，即可使其性能接近最优CFP，得到Aquamarine（QY=0.89，平均荧光寿命tf=4.12 ns）。Aquamarine具有优异的pH...
细胞依赖复杂且相互连接的信号通路网络来感知并解释胞外环境变化。基因编码荧光蛋白（FP）生物传感器的发展使研究者能够在活细胞中直接观察和表征这些胞内信号通路的时空动态。然而，当单独监测单个信号事件时，往往难以获得交叉通路之间精确的时序和空间关系。随着生物传感器技术不断进步，同时成像多个 FP 生物传感器正变得越来越可行，从而允许在同一...
本文报道了一种水溶性、生物相容的含蒽基侧链寡氮丙啶生物传感器，采用超临界二氧化碳中 N-取代氮丙啶的自由基聚合进行绿色合成。通过比较加入 100 当量金属氯化物溶液前后体系的荧光强度，考察了该传感器对一系列金属离子的结合能力。该传感器在水溶液中对金属阳离子表现出快速、简单且高光学灵敏度的双响应行为，即 off-on 与 on-off...
在基础与应用 HIV 研究中，可靠检测病毒组分对监测感染进展至关重要。虽然体外检测病毒结构蛋白已用于诊断，但此前无法在不进行病毒遗传修饰的情况下，直接在活细胞中动态可视化 HIV。本文报道一种新型荧光生物传感器，用于动态追踪 HIV-1 在活细胞中的形态发生。作者通过免疫骆驼并筛选单域抗体库，获得特异性结合 HIV-1 衣壳蛋白 C...
活细胞显微成像现已常规用于监测基因编码生物传感器蛋白的活性，以直接测量细胞、组织或生物体内特定信号事件。多数荧光生物传感器蛋白依赖 Förster 共振能量转移（FRET）报告信号事件引起的蛋白构象变化，通常用基于强度的比率成像测量。荧光寿命成像显微镜（FLIM）是另一种监测 FRET 型生物传感器蛋白活性的方法。FLIM 在时域测...