醇脱氢酶（ADHs）可用于还原性生物转化生产手性醇。本研究基于 NADPH 生物传感器 pSenSox 和荧光激活细胞分选（FACS），对乳酸乳杆菌来源的 NADPH 依赖型醇脱氢酶 LbADH 进行高通量筛选，寻找将 2,5-己二酮还原为 (2R,5R)-己二醇活性更高的变体。通过易错 PCR 构建约 1.4×10^6 个克隆的随...
脂肪酸衍生物在化学构建块到生物燃料等工业领域应用广泛。由于脂肪酸代谢高度动态，难以通过理性方法鉴定调节脂肪酸酰-CoA水平的基因。代谢物生物传感器可用于在体内以高通量方式筛选大规模基因库。本文在酿酒酵母中建立了基于大肠杆菌转录因子 FadR 的脂肪酸酰-CoA传感器，并与基因过表达库结合，筛选提高脂肪酸酰-CoA池的基因。经流式细胞...
白细胞介素-2诱导性T细胞激酶（ITK）在T细胞信号转导中发挥重要作用，是潜在药物靶点。由于蛋白激酶ATP结合位点高度保守，设计选择性激酶抑制剂仍具挑战。靶向激酶非活性构象有助于提高抑制剂选择性，因此从初筛命中物中识别能稳定非活性构象的化合物对选择性评估很重要。本研究使用去磷酸化ITK，通过ADP-Glo酶活检测对39万化合物库进行...
活细胞利用复杂且高度动态的信号网络和转录回路维持稳态，并响应不断变化的环境。这些网络使细胞能够严格控制离子、代谢物、蛋白质及其他生物大分子的胞内浓度，并在能量需求与生长所需分解代谢之间保持平衡。由于这些网络相互关联，且细胞系统对外部环境极为敏感，阐明遗传和药理扰动的分子机制仍具挑战性。活细胞成像结合遗传编码荧光生物传感器，为在细胞、...
在细胞间通讯中，物理与生化线索的相互作用对信息交换和功能协调至关重要，但在单个活细胞中可视化细胞间信号动态仍具挑战。本文报道一种基于激光微剪刀和 Förster 共振能量转移（FRET）显微镜的光学方法，用于研究细胞间信号传递。首先，利用高通量筛选平台开发了高灵敏 FRET 生物传感器 SCAGE，用于监测细胞间相互作用和信号级联的...
核因子κB（NF-κB）调控介导炎症反应和细胞增殖的多种基因表达，是慢性炎症疾病和癌症的治疗靶点。本文研究了一种用于检测NF-κB的新型分子结合方案，利用Ig-κB DNA探针与染料和猝灭剂荧光团的亲和力，并通过与Ig-κB DNA互补序列竞争验证其特异性。作者建立了归一化方程，以消除不同初始荧光团浓度和背景噪声带来的负面影响，并发...
我们开发了采用红色移位荧光蛋白（FP）的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，以改善时间分辨（荧光寿命）荧光测量性能。与绿色/红色 FRET 对（GFP/RFP）相比，发射波长更长的橙色和栗色荧光蛋白（OFP/MFP）提高了高通量筛选（HTS）中的 FRET 效率、动态范围和信噪比。将 OFP 和 MFP 融合到人心脏钙泵 SER...
近年来，重组细胞中 D-葡萄糖酸（GA）生产取得进展，亟需高通量筛选和选择性能更优的重组细胞或生物催化剂。2016 年已开发一种在大肠杆菌中将 GA 浓度转化为荧光信号的生物传感器系统，但其应用报道较少。本文建立了一种不依赖微流控平台等专用装置的有效高通量筛选方法，并进行初步应用。在该一锅双菌株体系中，含有 GA 合成途径的产酸菌或...
微小RNA（miRNA）是调控基因表达的重要非编码RNA，疾病相关miRNA表达调控对基础研究和治疗均具有重要意义。本文提出一种高通量筛选策略，用于在活细胞中鉴定调控miRNA表达的小分子。该策略基于由肽核酸（PNA）和纳米氧化石墨烯（NGO）组成的新型生物传感器，通过定量荧光信号实时监测活细胞内目标miRNA水平，并同时观察与mi...
我们建立了一种新型时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）检测方法，用于筛选能调节肌动蛋白-肌球蛋白结构与功能的小分子。肌动蛋白-肌球蛋白相互作用对细胞产生力和运动至关重要，其突变或翻译后修饰可破坏肌肉功能并导致危及生命的综合征。本研究将荧光供体连接在肌动蛋白 C374 位点，将非荧光受体连接在包含骨骼肌肌球蛋白必需轻链长亚型 N...
布氏锥虫引起人类非洲锥虫病，在哺乳动物宿主体内依赖葡萄糖代谢产生ATP。靶向葡萄糖摄取或调控是潜在治疗策略，但现有方法难以鉴定葡萄糖摄取与调控抑制剂。本文建立了一种基于FRET流式细胞术的高通量筛选方法，用于鉴定降低锥虫细胞质和糖体葡萄糖水平的小分子干扰物。作者将基因编码的荧光蛋白葡萄糖传感器FlII12PGlu-600µ分别表达于...
L-丝氨酸广泛用于医药、食品和化妆品工业。虽然谷氨酸棒杆菌可从糖直接发酵生产 L-丝氨酸，但产量仍较低。本研究以工程菌 C. glutamicum ΔSSAAI 为出发菌株，采用大气压室温等离子体（ARTP）诱变提高 L-丝氨酸产量，并基于特异性响应 L-丝氨酸的转录因子 NCgl0581 构建新型荧光生物传感器，通过荧光激活细胞分...
衣康酸是重要平台化学品，可替代石化丙烯酸或甲基丙烯酸。土曲霉、大肠杆菌和酿酒酵母等多种微生物已被用于生物合成衣康酸盐，但缺乏高通量筛选方法限制了高滴度菌株和条件的发现。本研究从假结核耶尔森氏菌和铜绿假单胞菌中鉴定出衣康酸诱导启动子及其相应LysR型转录调控因子。结果表明，YpItcR/Pccl诱导系统在模式γ-变形杆菌大肠杆菌和β-...
本文报道了用于多重高通量细胞G蛋白偶联受体（GPCR）检测的Nomad技术。该技术包含一组名为Nomad Biosensors的荧光生物传感器，可通过G蛋白与第二信使转导蛋白的相互作用，测量GPCR激活后的细胞响应。GPCR是欧几里得生物中最大的膜受体家族之一，其信号转导参与多种生理过程，并与多种疾病相关，是药物研发的重要靶点。No...
生物传感器是合成生物学中调控基因表达的重要工具。配体响应型转录因子可将胞内代谢物浓度与基因表达偶联，用于动态调控和高通量代谢物生产株筛选。本研究建立酿酒酵母WAR1转录调控因子与PDR12启动子构成的有机酸生物传感器，用于检测莽草酸途径产生的对羟基苯甲酸（PHBA），并以绿色荧光蛋白（GFP）表达作为输出。通过将WAR1转录调控因子...
细胞周期依赖性激酶（CDK）是癌症治疗的重要靶点，但临床候选抑制剂多靶向 ATP 结合口袋，选择性有限且易产生耐药。靶向蛋白激酶构象可塑性的别构抑制剂具有更好前景。本文针对 CDK2 激酶 T-loop 动态，构建了一种荧光生物传感器 CDKCONF，可特异性报告 CDK2 激活环构象变化，并对 ATP 或 ATP 竞争性抑制剂不敏...
基于蛋白的荧光生物传感器可在生理条件下高灵敏定量检测生物分子或药物，但传统构建方法通常依赖高分辨结构或氨基酸序列信息，限制了其在结构复杂膜受体中的应用。为克服该限制，作者发展了将配体导向化学与双分子荧光淬灭-恢复（BFQR）系统相结合的新策略，可将多种膜结合受体转化为“开启型”荧光传感器。本文以 γ-氨基丁酸 A 型受体（GABAA...
乙酰辅酶A是细胞重要中间代谢物，也是多种工业代谢物的前体。甲基杆菌 Methylobacterium extorquens AM1 能以甲醇为唯一碳源，具有丰富辅酶A代谢流，但乙酰辅酶A位于丝氨酸循环、三羧酸循环和乙基丙二酰辅酶A循环等中心代谢路径交汇处，难以高效积累。本文提出传感器辅助转录调控因子工程（SATRE）策略，在引入甲羟...
本研究建立了一种稳健的高通量筛选（HTS）策略，用于发现靶向肌浆/内质网钙ATP酶（SERCA）的小分子效应物。该策略基于荧光微孔板读取器，可同时高精度、高速记录纳秒荧光衰减波形（寿命模式）与完整发射光谱（光谱模式）。作者利用光谱解混微孔板读取器（SUPR），在活细胞中表达荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，筛选小分子化合物库。...
我们开发了一种可在真实高通量筛选（HTS）条件下逐孔记录完整高质量荧光发射光谱的微孔板读数仪，整板384孔读取时间少于3分钟。该仪器特别适合基于荧光共振能量转移（FRET）的活细胞检测。在HEK293细胞中稳定表达并研究了两色SERCA（2CS）分子内FRET生物传感器，其绿色荧光蛋白（GFP）供体与红色荧光蛋白（RFP）受体位于对...