本文研究环境敏感荧光染料在荧光寿命成像显微镜（FLIM）生物传感器中的应用。作者筛选了一系列 merocyanine 染料，寻找环境诱导荧光寿命变化、光稳定性和亮度在活细胞成像波长下的最佳组合。最终构建 mero87-CBD 生物传感器，将环境敏感染料通过半胱氨酸反应性连接基共价连接至选择性结合激活态 Cdc42 的亲和试剂（WAS...
ADAMTS（含血小板反应蛋白基序和金属蛋白酶域的血栓反应蛋白基序金属蛋白酶）是一类依赖Zn2+/Ca2+的分泌型蛋白酶，参与细胞外基质重塑及多种生理病理过程。本研究探讨ADAMTS-1是否参与细胞侵袭与迁移及其机制。作者通过条件培养基处理或CRISPR/Cas9敲除，改变卵巢癌细胞（CHO、NIH-OVCAR-3、ES-2）和NI...
Rho GTPase 家族参与肌动蛋白动力学并调控内皮屏障功能，其中 Cdc42 是主要的促屏障 Rho GTPase。目前内皮细胞中 Cdc42 信号网络的调控机制仍缺乏分子细节。本研究聚焦于内皮细胞中表达的 15 种 Rho 鸟苷酸交换因子（GEF），利用单细胞 FRET 生物传感器在原代人脐静脉内皮细胞中监测其对 Cdc42 ...
Netrin-1是胚胎脊髓中引导联合轴突向腹侧中线延伸的关键胞外趋化因子，其通过受体DCC调控生长锥F-肌动蛋白重组。DCC通过激活包含Rho GTPase Cdc42的胞内蛋白复合物，参与细胞极性与定向迁移调控。为解析Netrin-1下游信号事件的空间分布，作者在培养的胚胎大鼠脊髓联合神经元中表达FRET生物传感器Raichu-C...
尽管造血细胞特异性 Rac2 与经典亚型 Rac1 具有 92% 同源性，二者在免疫细胞中已被证明发挥非冗余功能。为研究活细胞中 Rac 的亚型特异性动态，作者开发了一种全基因编码、单链 FRET 型 Rac2 生物传感器，并对现有单链 Rac1 生物传感器进行了显著改进。作者优化了传感器构建体，使其易于在造血细胞中表达，并在 RA...
基于环境敏感荧光染料的生物传感器可用于在活体中报告内源蛋白活性。染料可连接至选择性结合目标蛋白特定构象的试剂，结合后引起荧光变化。适用于低浓度、非扰动细胞内检测的明亮染料通常只发生荧光强度变化，而非激发或发射峰位移，因此难以通过比率成像精确量化。本文报道了一种环境敏感染料 mero199，其激发峰随溶剂极性发生 33 nm 位移。利...
侵袭体是富含肌动蛋白的膜突起，可降解细胞外基质并驱动肿瘤侵袭；c-Src 与 Rho 家族 GTP 酶是其关键调控因子。侵袭体可重组为环状玫瑰花结，但机制不明。本文发现，A375M 与 MDA-MB-435 黑色素瘤细胞中 Src 诱导的侵袭体可被 GPCR 激动剂快速重塑为动态基质降解玫瑰花结，尤其是 LPA（经 LPA1）和内皮...
本文提出一种将全内反射荧光（TIRF）显微镜与稳态受体荧光各向异性测量相结合的活细胞成像系统，用于在细胞质膜处进行 Förster 共振能量转移（FRET）成像。作者直接比较了偏振分辨 TIRF 与透射荧光激发下的成像性能，并针对高数值孔径物镜在 TIRF 中引入的额外去极化效应进行了校正。该系统通过测量 Raichu-Cdc42 ...
Cdc42 是调控细胞极性、细胞骨架重排、迁移和膜转运等多种形态发生过程的关键小 GTP 酶，其激活动态需精确调控。为在活细胞中直接观察 Cdc42 激活，作者开发并验证了一种新的 Cdc42 激活生物传感器。该传感器为遗传编码、单链设计，可正确定位到膜区室，并能与其上游调控因子鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子（GDI）相互作用。作者在小鼠...
近期证据表明，内皮集落形成细胞（ECFCs）可作为改善血管损伤受试者血管形成的细胞治疗手段，主要源于其强血管生成潜力。Rho家族GTP酶Cdc42在该血管生成过程中起主要作用，但细胞外基质（ECM）刚度如何影响ECFC早期空泡形成过程中的Cdc42活性仍不清楚。本研究使用基于荧光共振能量转移（FRET）的Cdc42生物传感器，考察三...
功能成像可提供传统高内涵筛选难以达到的定量水平，因为现有高内涵系统多将单细胞表型分析放大，指标偏图像化且较主观。本文开发并验证了一种结合稳态荧光各向异性成像与荧光寿命成像（FLIM）的原型高内涵筛选平台，用于蛋白质-蛋白质相互作用检测中的小分子库客观定量筛选。作者介绍了仪器开发，并说明如何从宽场受体荧光各向异性成像中提取荧光共振能量...
本文提供了在单通道和多通道成像模式下对Rho家族GTPase生物传感器进行活细胞成像的实验程序。多通道方法可在单个活细胞中直接同时可视化两种生物传感器读数。作者以基于CFP/YFP FRET的RhoA生物传感器和基于溶剂极性敏感有机染料的Cdc42生物传感器为例，系统列出实现双比率型生物传感器成像所需的光学组件、滤光片、二向色镜、分...
自然杀伤（NK）细胞通过运动、识别和定向分泌等依赖细胞骨架重排的过程杀伤肿瘤和病毒感染细胞。Rho GTPase Cdc42 协调多种受体下游的细胞骨架重组。作者假设 NK 细胞与靶细胞相互作用时 Cdc42 活性可能发生振荡。利用 Cdc42 荧光共振能量转移（FRET）生物传感器和荧光寿命成像（FLIM），在活 YTS NK 细...
本文报道了一种基于分子内荧光共振能量转移（FRET）的 Wiskott-Aldrich 综合征蛋白（WASP）生物传感器（WASPbs），用于在活细胞内实时监测 WASP 的激活状态。该传感器将青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP）分别融合于全长 WASP 的 N 端和 C 端；WASP 处于自抑制闭合构象时 CFP-YFP...