过去十年已设计多种基于荧光共振能量转移（FRET）的细胞内环核苷酸检测生物传感器，但可用于环磷酸鸟苷（cGMP）的传感器较少，能检测低纳摩尔 cGMP 的更少。本研究旨在开发对 cGMP 具有高亲和力的 FRET 型 cGMP 生物传感器，作为细胞内信号研究工具。作者以恶性疟原虫 cGMP 依赖性蛋白激酶（PfPKG）羧基端环核苷酸...
理解阿尔茨海默病及相关 tau 病中异质性病理是发现疾病修饰疗法的关键挑战。本文提出一种基于时间分辨荧光共振能量转移（time-resolved FRET, TR-FRET）的细胞内生物传感器技术，用于监测细胞中自发形成的有毒与无毒 tau 寡聚体集合。tau 病以微管结合蛋白 tau 的病理性聚集为特征，近年证据提示可溶性 tau...
蛋白激酶表达与活性增强是肿瘤细胞增殖和癌症进展的关键，相关激酶形成复杂互作网络。为评估激酶抑制剂对信号网络的影响，作者建立了基于荧光共振能量转移（FRET）生物传感器的高内涵成像方法，用于在两种三阴性乳腺癌（TNBC）细胞系 HCC1806 和 Hs578T 中定量检测 ERK 和 AKT 活性。首先利用 EGF 刺激及不同 MEK...
Tau 蛋白聚集是 tau 蛋白病共同病理特征，其积累与细胞毒性和神经元退行性变直接相关。由于缺乏监测 Tau 聚集的合适方法，相关治疗研究进展缓慢。本研究建立了一种基于活细胞的检测体系，用于检测和定量活细胞内 Tau 聚集。该体系采用分子内 FRET 生物传感器 CST，可监测不同细胞条件下 Tau 聚集的分子动态。作者筛选了能够...
Förster 共振能量转移（FRET）在绿色荧光蛋白突变体之间被广泛用于监测蛋白质相互作用，并作为荧光生物传感器的读出模式。尽管荧光团之间的距离和分子夹角对 FRET 至关重要，但荧光蛋白 FRET 的结构细节一直缺乏。本文报道了荧光蛋白 mCerulean3 和 cpVenus 在生物传感器 Twitch-2B 内发生 FRET...
磷脂酸（PA）是植物中调控多种基本生物学过程的信号脂质，但现有 PA 检测方法难以在活体细胞和组织中精确解析其时空动态，导致 PA 作用机制仍不清楚。本研究开发了 PAleon，一种基于 Förster 共振能量转移（FRET）的 PA 特异性光学生物传感器，可报告质膜上具有生物活性的 PA 浓度及其动态变化。PAleon 对生理浓...
在多数微生物培养中，D-葡萄糖是主要碳源和能源，但小规模培养中葡萄糖定量仍具挑战。为此，作者开发了一种基于FRET的葡萄糖生物传感器，可用于微反应器培养。该传感器由葡萄糖结合蛋白MglB夹在两个荧光蛋白之间构成FRET对：青色荧光蛋白mTurquoise2作为供体，黄色荧光蛋白Venus作为受体。D-葡萄糖结合后，MglB发生构象变...
基因编码的FRET生物传感器是可视化活体细胞与组织中蛋白活性和信号事件的重要工具。与生化方法相比，FRET生物传感器可在活体中非侵入性地实现信号过程的空间—时间检测。尽管该技术概念相对简单，但实验流程复杂，包括传感器优化、数据采集和图像处理三个步骤，每一步均存在挑战。本章重点讨论数据采集与图像处理，并以分子内RacFRET生物传感器...
蛋白质相互作用常采用基于 Förster 共振能量转移（FRET）的定量分子显微镜研究。本研究将线性解混 FRET（lux-FRET）与基于 FRET 的环磷酸腺苷（cAMP）生物传感器 CEpac 联合应用，用于分析 5-HT7 受体（5-HT7R）与 5-HT1A 受体（5-HT1AR）之间的寡聚化及其对 cAMP 信号的重要性...
遗传编码 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器是实时感知细胞内信号转导时空动态的关键工具。随着对多条信号通路串扰研究的深入，FRET 生物传感器需要进一步优化，以便在单细胞中同时监测多种生化活性，并在传感器丰度较低时仍能检测其激活。本文报道了第二代 Aurora 激酶 A（AURKA）FRET 生物传感器的开发。首先，...
Lck在T细胞受体（TCR）信号中起关键作用。作者开发了一种新型高灵敏FRET生物传感器ZapLck，用于在活细胞中以高时空分辨率可视化Lck激酶活性。ZapLck显示，T细胞中约62%的Lck信号处于预激活状态。在Lck缺陷的JCam T细胞中，Lck预激活消失；用野生型Lck（LckWT）回补可将其恢复至51%，而推测失活的突变...
单分子GTP酶RalB由RalGEF激活，调控自噬与侵袭，但其多功能性机制不清。作者发现RalGEF RGL2除促进侵袭外，也是自噬所必需。他们开发自动图像分析方法Endomapper，用一个通道分割内膜区室、另一通道测量目标蛋白强度，并生成随机伪区室校正偶然共定位，以定量内源RGL2与RalB在早期内体、循环内体、自噬体和反式高尔...
钙离子振荡及其引发的钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）激活对胚胎发生以及神经、免疫和心脏信号传导至关重要。受精可直接诱发钙振荡，但随后CaMKII活性的动态模式仍不清楚。为弥补这一空白，作者首先使用现有唯一CaMKII激活生物传感器Camui；该传感器包含CaMKIIα，因此仅报告这一变体的激活。为同时检测所有内源CaM...
环磷酸腺苷磷酸二酯酶（PDE）是心脏β肾上腺素能受体（β-AR）信号的重要调节因子。PDE3通常被认为是大型哺乳动物和人心脏中的主要cAMP水解酶，而PDE4在啮齿动物中占优势，但其在大型哺乳动物中的功能仍不清楚。本研究以猪心这一相关临床前模型，探讨PDE4对cAMP水解和兴奋-收缩耦联（ECC）的作用。作者利用FRET生物传感器在...
ERK/MAPK 通路激活是小鼠胚胎干细胞（ESCs）退出多能性并启动分化所必需的，但单个细胞中 ERK 活性的动态变化仍不清楚。作者利用基于 FRET 的基因编码生物传感器 EKAREV，实时监测分化过程中单个小鼠 ESC 的 ERK 信号动态。结果显示，ERK 活性在 ESC 群体中高度异质，同一克隆内单个细胞间存在显著差异；不...
分子拥挤对生物大分子结构与动力学性质的影响不仅取决于拥挤剂浓度，还取决于拥挤剂的分子量和结构紧密程度。本文采用荧光相关光谱（FCS）研究了分子量从17 kDa到2.7 MDa的多种生物大分子在模拟拥挤环境中的平移迁移性。实验在缓冲液中使用不同分子量的聚乙二醇（PEG）和Ficoll聚合物作为拥挤剂，分析生物示踪分子扩散系数随拥挤剂体...
本补充说明针对此前报道的用于坏死性凋亡（necroptosis）的 FRET 生物传感器进行更正。作者指出，原文章中所述的人源 SMART 生物传感器并不包含用于替代 MLKL 对应 a 区和 b 区的 SAGG 重复序列。在收到小鼠和人源 SMART cDNA 的请求后，作者发现人源 SMART 序列与人源 α15 完全相同，而 ...
巨胞饮是巨噬细胞中普遍且必需的途径，参与抗菌反应和固有免疫功能。细胞表面皱褶可形成吞噬体和巨胞饮体，作为多功能区室参与环境采样、病原体进入、质膜更新和受体信号。快速高分辨率晶格光片成像显示巨噬细胞皱褶具有高度动态性。病原体介导的表面和内体 Toll 样受体（TLR）激活可上调巨胞饮。本文利用多种成像和显微技术，追踪活巨噬细胞中膜结合...
植物激素赤霉素（GA）是一类小分子可移动信号分子，在种子萌发、细胞伸长和发育转变中发挥关键作用。GPS1 是首个基于 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器，可在活体植物细胞内监测 GA 水平。通过测量核定位 nlsGPS1 的荧光发射比，可在细胞尺度对内生和外源 GA 梯度进行时空映射。本方案描述了三种示例实验：稳态...
肌动蛋白细胞骨架的重排部分依赖于Rho家族小GTP酶在局部动态激活与失活。SWAP70可结合并激活小GTP酶RAC1，同时结合丝状肌动蛋白和PIP3。本研究构建了一种编码型生物传感器，利用Förster共振能量转移（FRET）在活细胞中实时显示SWAP70的构象变化。该传感器将mTurquoise和Venus分别融合于SWAP70两...