监测细胞表面酶活性具有挑战性，因为基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器在转运和膜整合方面效率较低。为此，作者开发了一种供体与受体分离、可在原位组装的混合生物传感器。通过整合定向进化与序列-功能分析，作者工程化了一种 monobody 变体 PEbody，使其能够特异性结合藻红蛋白 R-PE。PEbody 可用于可视化细胞间连...
大环内酯是一类具有广泛强效生物活性的天然产物，由 I 型聚酮合酶（PKS）及相关酶机器生物合成。药物发现、药物生产和探针开发迫切需要获取大环内酯及其非天然衍生物。通常，在不同微生物宿主中工程化大环内酯及其类似物生物合成的努力，受限于大环内酯生物合成途径的复杂性，以及我们理性重编程 I 型 PKS 和 PKS 后修饰机器的能力有限。基...
本研究对大肠杆菌 lac 操纵子阻遏蛋白 LacI 的效应物结合特异性进行工程改造。基于 LacI 饱和突变文库，采用流式细胞分选（FACS）正负双筛选策略，获得突变体 LacI-L5。该突变体能被乳果糖特异性诱导，而乳糖、表乳果糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖和蜜二糖等双糖均不能诱导其表达。基于 LacI-L5 构建了全细胞乳果糖生物传...
量化蛋白在活系统中的位置与浓度对理解其功能至关重要。SuCESsFul（支架偶联环境敏感荧光团）生物传感器将分析物识别与荧光信号转导整合于同一分子，可在高时空分辨率下检测目标蛋白，但其开发长期依赖大量经验筛选。作者系统表征了超过400种由不同蛋白分析物、结合支架和环境敏感荧光团组成的传感器，发现仅少数组合具有大于2倍的荧光动态范围。...
大肠杆菌转录调控蛋白 AraC 可响应 L-阿拉伯糖调控 ara 基因表达。为开发遗传编码分子报告器，作者此前通过同时随机化配体结合口袋五个位点，并经多轮正负荧光激活细胞分选（FACS），筛选出响应三乙酸酸内酯（TAL）的 AraC 变体 AraC-TAL1。本文表明，改变筛选方案可从同一 AraC 文库中鉴定出 9 个新的 TAL...
合成营养缺陷型是通过工程化改造使生物体必须依赖特定分子才能存活的系统。本文提出并验证了一种基于配体依赖必需基因（SLiDE）的合成营养缺陷型构建方法，将配体依赖性引入大肠杆菌必需基因，使突变蛋白仅在特定小分子存在时恢复功能。研究以 pheS、dnaN、tyrS、metG、orn 和 adk 六个必需基因为测试对象，通过定向进化、温度...
本文评论了 DeLoache 等构建的左旋多巴（L-DOPA）比色生物传感器及其在酵母代谢工程中的应用。苯基异喹啉生物碱（BIAs）的微生物合成长期受限于多巴胺水平不足，而酪氨酸羟化酶在酵母中活性低且易将 L-DOPA 过度氧化为多巴醌（dopaquinone）。作者利用 DOPA 双加氧酶将 L-DOPA 转化为黄色色素 beta...
砷广泛存在于生物圈，来源包括自然与人为排放，其毒性及致癌风险使快速、低成本的原位检测具有重要意义。基于基因工程细菌的生物传感器在检测砷及其毒性方面具有应用前景，但多数现有系统依赖野生型底物诱导启动子，特异性、亲和力和灵敏度有限，制约了现场与商业化应用。本研究建立了一种体内定向进化与双向筛选策略，通过优化可诱导操纵子提高亚砷酸盐响应细...
漆酶是一类多铜氧化还原酶，因底物谱广、以分子氧为电子受体且仅生成水，被视为绿色催化剂，可用于生物燃料、生物修复、有机合成、纸浆生物漂白、纺织、食品饮料、生物传感器和生物燃料电池等领域。21世纪以来，细菌和真菌漆酶的特性被系统改造，以满足工业上对高催化活性、高稳定性、低成本生产以及耐受有机溶剂、离子液体和生理流体等要求。本文综述了漆酶...
定向进化是提升低活性酶催化能力的重要策略，尤其适用于酶被改造以接受新底物或适应新环境的情形。由于酶活性强烈依赖其微环境，筛选条件应尽量接近最终应用场景。当目标酶需要在活细胞内发挥作用时，RNA 生物传感器可将难以直接测量的代谢表型，即目标小分子的生成，与易于检测的荧光表型相连接，从而在活细胞内实现高通量筛选。本文介绍了一种基于合成 ...
葡萄糖氧化酶（GOx）对β-D-葡萄糖具有高特异性和高稳定性，适合糖尿病护理中的葡萄糖检测，但其活性强烈依赖氧气，可能导致安培法β-D-葡萄糖测定不准确。作者以GOx变体T30V I94V为起点，采用醌二亚胺介体，通过SeSaM和易错PCR两轮随机突变、单点饱和突变以及OmniChange四位点同时饱和突变进行定向进化，并建立基于醌...
合成烷烃诱导型生物传感器可用于环境烃污染检测，也可作为低成本诱导剂的新型诱导表达系统。本研究利用假单胞菌 Pseudomonas putida 烷烃代谢调控机制，在大肠杆菌 Escherichia coli 中组装并进化了一种具有荧光输出信号的烷烃响应生物传感器。在该系统中，转录调控蛋白 AlkSp 在烷烃存在时被激活，并结合 Pa...
本研究对葡萄糖氧化进行了电化学表征，比较了由定向蛋白质进化获得的突变葡萄糖氧化酶 B11-GOx 与野生型葡萄糖氧化酶 wt-GOx 在溶液及酶聚合物电极中的性能。实验采用循环伏安法、线性扫描伏安法和计时电流法，在含二茂铁介体的磷酸缓冲液以及固定于聚(乙烯基二茂铁-co-2-羟乙基甲基丙烯酸酯) 膜上的酶电极体系中考察葡萄糖氧化电流...
代谢工程用于高价值小分子过量生产，依赖定向进化提高产量。多数目标小分子无色且难以直接筛选。本文综述高通量比色、荧光和生长偶联筛选技术的发展，实现无色小分子检测。首先概述标准定向进化流程中文库构建、转化和筛选的通量限制，并基于小分子检测通量和灵敏度建立筛选与选择阶梯。随后深入分析已证明的小分子检测筛选与选择方法，重点介绍体内生物传感器...
细胞色素P450（CYP）是一类广泛存在的血红素单加氧酶超家族，可催化C-H羟基化、N-去烷基化、O-去烷基化、S-氧化和环氧化等氧化反应，在药物代谢、毒理学、生物催化和环境修复中具有重要价值。本文综述了CYP生物催化剂在生物技术、医学和环境修复中的应用进展，包括药物及药物代谢物合成、基因导向酶前药疗法（GDEPT）激活环磷酰胺和异...
荧光蛋白已成为生物医学研究中重要的蛋白标签、基因表达报告分子、生物传感器组分和细胞谱系追踪工具。然而，由于血红蛋白对 600 nm 以下激发光的强吸收，哺乳动物深组织活体成像受到限制，因此需要能在 600 nm 以上“光学窗口”内有效激发的荧光蛋白。本文通过定点突变和随机突变定向进化，从 Discosoma 和 Entacmaea ...
许多生物传感器依赖分子识别试剂实现高灵敏、高特异检测，而识别试剂的亲和力与特异性往往决定仪器最终性能。抗体因能高亲和、高特异结合多种抗原，被广泛用作生物传感器识别元件。重组体外抗体展示技术，尤其是酵母细胞表面展示，可在保留其他性质的同时增强特定抗体属性。本章介绍一种基于酵母表面展示的抗体亲和力成熟方案：从杂交瘤细胞分离 VH 和 V...
本文介绍利用酵母表面展示技术对生物传感器中的生物受体进行定向进化，以获得更稳定、更高亲和力的配体结合分子。生物传感器通常由识别配体的生物受体和将结合事件转换为可测信号的换能器组成；其中受体的结合强度、特异性和稳定性直接决定检测灵敏度、重复使用能力和长期储存性能。作者以酿酒酵母 EBY100 和 pCT302/pYD1 展示载体为基础...
测定食品和生物样品中D-氨基酸含量具有重要意义。本研究开发了一种基于红发酵母（Rhodotorula gracilis）黄素酶D-氨基酸氧化酶（RgDAAO）的生物传感器。为使D-氨基酸组成不改变检测结果，作者同时采用野生型及通过理性设计和定向进化获得的突变体。对D-氨基酸氧化酶突变体在不同中性、酸性和碱性底物比例混合物中的活性分析...