Spatiotemporal activation of Rac1 for engulfment of apoptotic cells.
吞噬凋亡细胞需要吞噬细胞协调激活调控肌动蛋白动力学的 Rho 家族 GTP 酶。本研究利用 FRET 生物传感器实时可视化吞噬凋亡细胞过程中 Rac1 的时空激活。结果显示，凋亡细胞通常被吞噬细胞的片足吞噬，而片足区域 Rac1 处于激活状态；同一片足部位常连续吞噬多个凋亡细胞，提示存在凋亡细胞进入的门户。在该位置，激活的 Rac1...
FRET evidence that an isoform of caspase-7 binds but does not cleave its substrate.
本研究基于荧光共振能量转移（FRET）构建了 caspase-7 生物传感器 vDEVDc，用于研究细胞凋亡执行蛋白酶 caspase-7 的蛋白水解特性。vDEVDc 由 ECFP 供体、含 DEVD 识别序列的 24 氨基酸连接肽和 Venus 受体组成。N 端缺失 56 个残基的活性同工型 57casp7 可在识别序列处切割 ...
Visualization of phosphatase activity in living cells with a FRET-based calcineurin activity sensor.
蛋白激酶和磷酸酶在细胞内形成复杂的信号网络，其活性需要在空间和时间上精确协调。为理解信号转导网络的调控机制，有必要在天然细胞环境中定义蛋白激酶和磷酸酶的时空动态。本文报道了一种遗传编码蛋白生物传感器的开发，用于特异性探测钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白磷酸酶钙调磷酸酶（calcineurin, CaN）的活性。该报告分子采用磷酸酶活性依赖...
Visualization of polarized membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in live cells by fluorescence resonance energy transfer imaging.
膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）通过蛋白水解重塑细胞外基质，在癌细胞生物学中发挥关键作用。本研究利用荧光共振能量转移（FRET）成像技术开发了一种新型生物传感器，其传感元件锚定于细胞膜细胞外表面，可在活细胞中以亚细胞分辨率动态可视化 MT1-MMP 活性。表皮生长因子（EGF）在表达 MT1-MMP 的癌细胞中诱导显著 FRE...
Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.
荧光共振能量转移（FRET）结合荧光蛋白是检测细胞内蛋白相互作用、酶活性和小分子的重要方法。受一种新型紫激发黄色荧光蛋白的启发，作者开发了基于双FRET的caspase-3生物传感器。由于两套FRET对具有明显不同的激发光谱，每个FRET生物传感器在另一个存在时均可进行比率成像。文中报道了通过定向进化获得的紫激发黄色荧光蛋白mAme...
Analysis of K-Ras phosphorylation, translocation, and induction of apoptosis.
K-Ras 通过 C 端法尼基异戊二烯修饰和邻近多碱性区与质膜结合，其膜定位可受多碱性区净电荷调节。蛋白激酶 C（PKC）磷酸化多碱性区 Ser181 可中和正电荷，从而调节法尼基-静电开关，控制 K-Ras 与质膜的结合；该开关激活还可促进凋亡。本章介绍多种方法：利用 32P 代谢标记、免疫沉淀、SDS-PAGE 和磷成像直接分析...
Fluorescence and bioluminescence procedures for functional proteomics.
本综述概述了功能蛋白质组学中用于研究蛋白定位、蛋白-蛋白相互作用、细胞内信号事件和第二信使生成的当前光学方法。文章讨论了利用荧光蛋白或生物发光蛋白标记的报告基因检测，以及近年来发展的细胞内生物传感器检测、基于流式细胞术的荧光细胞条形码、结合RNA干扰与自动成像的转染细胞微阵列等筛选平台。这些新方法可用于小分子注释、信号事件研究和表型...