遗传编码的荧光蛋白（FP）生物传感器可用于监测活细胞和组织中的细胞事件。由于多数探针最初针对单光子激发设计，其宽双光子激发（2PE）截面和尚未充分理解的漂白特性，使双光子激光扫描显微镜（TPLSM）应用困难。本文提出一种简化FRET型荧光生物传感器在TPLSM中使用的方案。首先利用活细胞中表达的FRET标准蛋白评估并优化TPLSM系...
心衰中肌丝蛋白异常磷酸化参与收缩功能障碍，但其调控机制不清。本研究构建了一种新型遗传编码蛋白激酶A（PKA）生物传感器，将其锚定于兔心肌细胞肌丝，用于检测肾上腺素刺激下肌丝局部PKA活性。结果显示，在肥厚性衰竭兔心肌细胞中，PKA活性由肌膜向肌丝转移；肌丝PKA活性增强源于β2肾上腺素受体（β2AR）信号选择性导向肌丝，以及肌原纤维...
锥体感光细胞对高分辨率昼视和色觉至关重要，遗传性视网膜疾病中锥体丢失严重影响视觉，但锥体死亡机制不清。既往研究提示钙稳态缺陷在感光细胞退行中起核心作用，但缺乏哺乳动物退行锥体中钙的生理测量。本研究利用 HR2.1:TN-XL 转基因小鼠，该品系在锥体中特异性表达遗传编码钙生物传感器 TN-XL，并与原发性锥体退行模型 cpfl1 和...
金纳米信标（Au-nanobeacons）已被证明是分子诊断和治疗执行器的多功能体系。本文报道并表征了两种结合 Förster 共振能量转移（FRET）光谱编码的金纳米信标，用于双模式序列判别。该策略将两种强效技术整合于单一纳米体系。作者以慢性髓系白血病中最常见的融合序列 e13a2 和 e14a2 为模型，验证了该概念。检测基于供...
FMN结合荧光蛋白（FbFPs）由于氧独立性、体积小和成熟快而优于GFP及其衍生物。FbFPs已成功用作原核和真核细胞质中基因表达的可靠报告蛋白。本文扩展了前期关于密码子适配的CaFbFP变体的发现，该变体在非致病酵母酿酒酵母和人类真菌病原体白色念珠菌中发挥作用。在这两种真菌中，CaFbFP可通过内源信号（H2B-/Aga2-融合）...
钙离子（Ca2+）介导的信号转导是真核生物中保守的调控机制，也存在于人类疟疾病原体恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）中。由于疟原虫体积小于10 μm，其胞内Ca2+测量在技术上具有挑战性，因此该病原体中Ca2+调控机制尚不清楚。本研究采用表达黄色变色龙（yellow cameleon, YC）-Nano Ca2...
基因编码的Förster共振能量转移（FRET）生物传感器可用于报告离子和小分子相对浓度、蛋白构象变化、翻译后修饰及蛋白相互作用，通常通过荧光强度比率分析定量。本文以拟南芥中检测无机磷酸盐（Pi）的FRET生物传感器cpFLIPPi-6.4m为例，建立了基于共聚焦显微镜的比率成像定量方法。作者对供体eCFP、受体cpVenus及FR...
Förster 共振能量转移（FRET）已成为在单细胞中监测蛋白折叠、相互作用与定位的有力工具。基于 FRET 的生物传感器能够以高时间分辨率和空间分辨率实时可视化活细胞内的亚细胞信号事件。本文介绍一种基因编码胆汁酸传感器（BAS）的应用。该传感器由两个荧光蛋白融合到法尼醇 X 受体配体结合域（FXR-LBD）构成，可被多种胆汁酸及...
T细胞激活依赖于T细胞受体下游持续钙信号，但抗原呈递细胞刺激后体内钙流动力学仍不清楚。既往基于T细胞运动的研究提示，淋巴结中初始T细胞激活分为两个阶段：阶段I为与树突状细胞多次短暂接触，阶段II为稳定聚集。虽然推测阶段I存在信号，但从未直接证明。由于钙染料随时间流失限制长期活体成像，作者构建了表达改良Cameleon荧光共振能量转移...
钙离子（Ca2+）信号是免疫受体（如B细胞抗原受体BCR）介导的典型现象，对其生物学活性至关重要。为同时分析免疫受体信号及其体内动态，作者基于Cre/loxP系统构建了稳定表达FRET型钙离子指示剂黄色变色龙3.60（YC3.60）的转基因小鼠（YC3.60flox）。成功获得在免疫细胞或神经细胞中特异性表达YC3.60的小鼠，以及...
分子建模与模拟是结构生物学中用于提出功能假说和解释光谱实验的重要工具。本文描述一种构建荧光融合蛋白计算机模型的方法：将青色荧光蛋白（CFP）连接至肌浆/内质网钙ATP酶（SERCA）的执行域，形成 CFP-SERCA 融合蛋白。该 CFP-SERCA 构建体是一种生物传感器，可报告 SERCA 胞质头部在钙结合等过程中的结构动态。作...
本文报道一种基于荧光共振能量转移（FRET）的信号开启型分裂适配体生物传感器，用于高灵敏、高特异检测肿瘤细胞。早期肿瘤患者血液中肿瘤细胞数量少，且复杂基质和细胞内吞易造成高背景，限制现有方法灵敏度与特异性。作者利用 cell-SELEX 筛选的适配体 ZY11，将其茎区切割为 Split A 和 Split B，并分别在 3' 端标...
NADP+是细胞电子传递反应中关键的氧化型辅酶，其胞质或细胞器内浓度会因转化为多种重要衍生物而动态变化。为在单活细胞中追踪NADP+浓度，作者开发了一种基因编码的NADP+生物传感器：在青色荧光蛋白（CFP）与黄色荧光蛋白（YFP）构成的Förster共振能量转移（FRET）对之间插入报告元件KPR（ketopantoate red...
受体酪氨酸激酶（RTK）的自催化磷酸化可产生多样、依赖细胞环境的信号响应，但也带来配体非依赖的自主激活风险。作者构建了一种遗传编码的构象生物传感器 LIFEA2，用于在活细胞中实时报告 EphA2 激酶活性。该传感器将单体柠檬黄 mCitrine 插入 EphA2 近膜区（JMS），并将单体樱桃 mCherry 融合于 C 端，通过...
我们此前发现，当乳酸作为唯一底物时，培养神经元的突触传递会失败。为检验突触传递失败是否源于能量供应不足，本研究采用基因编码的 FRET 型 ATP 生物传感器 ATeam1.03YEMK 监测培养谷氨酸能神经元中的胞质 ATP 水平。实验以 30 μM NMDA 给予两次 30 s 脉冲、间隔 4 min 诱导突触活动，并在 1 m...
信号分子生物传感器可结合蛋白工程、荧光成像与细胞生物学，用于研究生理过程。遗传编码生物传感器的构建通常依赖既特异又稳定的结合核心，再与荧光分子偶联形成传感元件；但自然界中常缺乏满足要求的结合蛋白，且现有传感器在稳定性方面仍需改进。祖先蛋白重建是一种可产生高稳定性功能蛋白的蛋白工程方法。本研究以 L-精氨酸为对象，利用祖先蛋白重建与环...
环二鸟苷酸（c-di-GMP）是细菌第二信使，传递内外信号并调控运动性与生物膜形成。许多细菌编码上百种 c-di-GMP 调节酶，但只有少数酶的活性信号被明确。作者开发并应用一种高通量、实时流式细胞术方法，利用基于荧光共振能量转移（FRET）的游离 c-di-GMP 生物传感器，在鼠伤寒沙门氏菌中筛选能调节其浓度的信号。该方法鉴定出...
视网膜锥体光感受器负责昼视和色觉，其退行性病变常导致多种视网膜疾病致盲。钙离子是光感受器信号转导与代谢中的关键第二信使，并被认为与光感受器退行性变间接相关。然而，系统研究锥体生理与病理生理受到小鼠中锥体数量少、电生理记录困难等限制。为此，作者建立了一种双光子钙成像方案，使用转基因小鼠 HR2.1:TN-XL，在人红视蛋白启动子 HR...
本文报道了一种基于DNA酶（DNAzyme）的荧光生物传感器，用于检测Pb2+。传感器中，荧光素酰胺（FAM）标记的底物17S-FAM与DNA酶17E退火后形成凸起结构；DNA嵌入剂溴化乙锭（EB）插入双链区。激发FAM时，FAM向EB发生荧光共振能量转移（FRET），使FAM荧光显著降低。当存在Pb2+时，DNA酶被激活并切割底物...
3',5'-环腺苷一磷酸（cAMP）是广泛存在的第二信使，通过在不同亚细胞微区中作用调节多种生理功能。虽然已有多种靶向 cAMP 生物传感器用于单细胞研究，但其在体内、尤其是疾病背景下能否成功应用仍不清楚。本文建立了一种表达靶向 cAMP 传感器的转基因小鼠模型，用于分析肌浆网/内质网钙 ATP 酶（SERCA）附近微区特异性第二信...