Measuring Protein Interactions by Optical Biosensors.
本文介绍利用光学生物传感器（如表面等离子共振、干涉或波导生物传感器）测定可逆蛋白相互作用的平衡与动力学的基本方法。重点说明如何在较少假设下获得可靠结果，并讨论常见实验伪影的避免。光学生物传感器利用表面限制电磁场实时监测传感表面附近折射率变化；将一种结合组分固定为配体，另一种可溶组分作为分析物，结合使表面质量增加，信号近似正比于表面结...
Genetically encoded biosensors for visualizing live-cell biochemical activity at super-resolution.
细胞生化活性具有区室化特征，但目前缺乏可在活细胞中按区室化尺度可视化动态蛋白活性的通用方法。本文提出一类新的荧光生物传感器，可在活细胞中检测生化活性，空间分辨率最高比衍射极限提高三倍。这些 FLINC（接触诱导荧光涨落增强）生物传感器利用结合引起的蛋白荧光动力学变化，将激酶活性或蛋白-蛋白相互作用转化为荧光涨落变化，并可通过随机光学...
Low-Volume Label-Free Detection of Molecule-Protein Interactions on Microarrays by Imaging Reflectometric Interferometry.
本文报道了一种用于微阵列高通量蛋白相互作用分析的无标记检测系统。作者采用单波长成像反射干涉（1λ-iRIf）作为检测技术，并制备显微镜载玻片格式的微流控流池，以降低试剂消耗并兼容常规实验室操作。与成像表面等离子共振、石英晶体微天平或生物层干涉相比，该系统对温度漂移更稳健，且可分析更大阵列。系统空间分辨率为7 µm，时间分辨率≤50 ...
Determination of half-maximal inhibitory concentration using biosensor-based protein interaction analysis.
半数抑制浓度（IC50）是评价药物效力最常用且信息量最大的指标，表示抑制某一生物学过程一半所需药物量，从而为药理学研究中拮抗药物效力提供度量。目前测定药理化合物 IC50 的方法多基于全细胞体系，虽然通常可提供优异的效力信息，但结果可能依赖所用实验细胞系，且不能区分化合物抑制特定相互作用的能力。本文以分泌型转化生长因子-β（TGF-...
Identification of TgAtg8-TgAtg3 interaction in Toxoplasma gondii.
自噬是真核细胞中降解细胞器和胞质成分的重要过程，在弓形虫中可能参与调节寄生虫存活或死亡。Atg8 与 Atg3 的相互作用是 Atg8 脂化和自噬的关键调控环节，但此前缺乏其在弓形虫中发生的直接证据。本研究首先利用间接免疫荧光（IFA）发现 GFP-TgAtg8 转基因速殖子中 TgAtg8 与 TgAtg3 部分共定位。随后，将 ...
LRIG1 extracellular domain: structure and function analysis.
作者利用杆状病毒系统在昆虫细胞中表达并纯化了三个人源LRIG1胞外域（LRIG1-ECD）可溶片段：LRIG1-LRR（富含亮氨酸重复）结构域、LRIG1-3Ig（免疫球蛋白样）结构域和LRIG1-LRR-1Ig片段。其中LRIG1-LRR和LRIG1-3Ig结晶，分别解析了2.3 Å和2.76 Å分辨率的三维结构；并基于LINGO...
Quartz crystal microbalance with dissipation and microscale thermophoresis as tools for investigation of protein complex formation between thymidylate synthesis cycle enzymes.
胸苷酸合成酶（TS）和二氢叶酸还原酶（DHFR）在 DNA 合成、修复和细胞分裂中起关键作用，它们催化胸苷酸生物合成循环中的两个连续反应。任一酶缺失都会导致细胞胸苷酸缺乏死亡，因此抑制其酶活性是癌症化疗和其他疾病治疗的常用且有效手段。然而，胸苷酸合成循环的详细机制，尤其是循环酶之间的相互作用及其作用仍不清楚。本文首次证明人源 TS ...
Proliferation and migration activities of fibroblast growth factor-2 in endothelial cells are modulated by its direct interaction with heparin affin regulatory peptide.
血管生成是生理过程，涉及从已有血管长出新血管。在正常或病理血管生成中，血管生成生长因子激活内皮细胞上的相应受体。成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）和肝素亲和调节肽（HARP）是两种肝素结合生长因子，已被报道对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）具有促血管生成作用。本文显示 HARP 可作为 FGF-2 刺激效应的介导者，能够抑制 FGF...
Harnessing the unique structural properties of isolated α-helices.
α-螺旋是蛋白质中普遍存在的二级结构，通常需三级或四级相互作用稳定。自核糖核酸酶A孤立C肽中意外观察到α-螺旋形成以来，越来越多证据表明约0.2%的蛋白质含有孤立稳定单α螺旋结构域（SAH）。这些SAH结构域提供对正常蛋白功能至关重要的独特结构特征。部分SAH结构域含有特征性ER/K基序，即约4个连续谷氨酸后接约4个连续精氨酸或赖氨...
Seed sequence-matched controls reveal limitations of small interfering RNA knockdown in functional and structural studies of hepatitis C virus NS5A-MOBKL1B interaction.
丙型肝炎病毒（HCV）依赖宿主和病毒因子完成生命周期。作者利用蛋白质组学和酵母双杂交方法发现宿主蛋白 MOBKL1B 与 HCV 非结构蛋白 NS5A 相互作用。最初 siRNA 敲低实验提示 MOBKL1B 参与 HCV 复制，促使作者开展生化和结构研究。1.95 Å 的核心 MOBKL1B–NS5A 肽复合物共晶结构显示，NS5...
In situ protein microarrays capable of real-time kinetics analysis based on surface plasmon resonance imaging.
近年来，原位蛋白合成微阵列技术可在需要前即时制备蛋白微阵列。本文利用TUS-TER固定技术，结合表面等离子共振成像（SPRi），实现蛋白-蛋白相互作用的无标记实时动力学检测。作者构建了带C端TUS融合标签的可表达质粒DNA，将原位合成的重组蛋白定向固定于生物传感器表面。表达质粒固定于聚乙烯亚胺（PEI）修饰的金表面，并在SPRi仪器...
Biosensor-based approach identifies four distinct calmodulin-binding domains in the G protein-coupled estrogen receptor 1.
G蛋白偶联雌激素受体1（GPER）参与多种细胞功能，但其调控机制不清。本文报道一种FRET生物传感器方法，用于识别GPER为钙调蛋白（CaM）结合蛋白、定位结合位点并表征结合特性。原代血管平滑肌细胞中，GPER与CaM静息状态共免疫沉淀，经17β-雌二醇、GPER激动剂G-1或噻孢苷处理后增强。作者构建由增强青色荧光蛋白（ECFP）...
Prohibitin-2 binding modulates insulin-like growth factor-binding protein-6 (IGFBP-6)-induced rhabdomyosarcoma cell migration.
胰岛素样生长因子结合蛋白6（IGFBP-6）可通过抑制IGF-II作用降低肿瘤细胞增殖与存活，但近年发现其还能以IGF非依赖方式促进横纹肌肉瘤（RMS）细胞迁移，且涉及MAPK通路，具体分子机制不清。本研究报道膜蛋白prohibitin-2（PHB2）是IGFBP-6诱导RMS细胞迁移的关键调控因子。PHB2与IGFBP-6在RMS...
Using FRET to analyse signals controlling cell adhesion and migration.
细胞黏附与迁移是动态复杂过程，需要在特定亚细胞位点对信号级联进行严格时间控制。数十年来，生化方法鉴定了协调黏附、膜突起和收缩从而驱动迁移的众多信号通路，但理解这些信号如何在单个迁移细胞的不同位点内被调控，对于阐明运动过程中通路整合至关重要。荧光蛋白变体的最新进展使开发探针成为可能，利用显微镜分析单细胞中蛋白构象、激活或相互作用的局部...
Kinetic and mechanistic differences in the interactions between caldendrin and calmodulin with AKAP79 suggest different roles in synaptic function.
本研究采用基于生物传感器的方法，测定钙端蛋白（caldendrin, CDD）、钙调蛋白（calmodulin, CAM）与 A 蛋白激酶锚定蛋白 79（AKAP79）B 域之间的相互作用动力学和机制。表面等离子共振（SPR）结果显示，CDD 与 CAM 在 AKAP79 上存在竞争性结合，提示二者结合位点重叠。尽管两者对 AKAP...
ABRF-MIRG benchmark study: molecular interactions in a three-component system.
高通量蛋白质组学技术不断揭示蛋白互作网络，但同一靶蛋白同时结合多个配体时，如何准确判断多蛋白复合物能否组装以及不同配体是否竞争同一结合位点，仍是重要挑战。ABRF-MIRG 开展了一项以生物传感器技术为核心的基准研究，评估各实验室利用表面等离子共振（SPR）等技术正确描述两蛋白配体与靶蛋白相互作用的能力。参与者获得微克级三种未知蛋白...
PrPC interacts with potassium channel tetramerization domain containing 1 (KCTD1) protein through the PrP(51-136) region containing octapeptide repeats.
为鉴定细胞朊蛋白（PrPC）的分子相互作用伙伴，作者对牛脑 cDNA 表达文库进行酵母双杂交筛选，鉴定出钾通道四聚化结构域蛋白 1（KCTD1）为 PrPC 相互作用蛋白。删除图谱显示，PrPC 通过无规卷曲的 PrP51-136 区域特异性结合 KCTD1。作者进一步通过体内共免疫沉淀和体外生物传感器实验确认 PrPC 与 KCT...
Atomic Force Microscopy Study of Protein-Protein Interactions in the Cytochrome CYP11A1 (P450scc)-Containing Steroid Hydroxylase System.
本文采用原子力显微镜（AFM）和光子相关光谱（PCS）监测无磷脂条件下细胞色素CYP11A1在溶液中的单体化过程。结果表明，100 μM CYP11A1与12% Emulgen 913在50 mM KP、pH 7.4中22°C孵育10 min，可使血红素蛋白聚集体解离为单体，单体化程度为(82±4)%，且单体化后CYP11A1仍保持...
Kinetic and optical biosensor study of adrenodoxin mutant AdxS112W displaying an enhanced interaction towards the cholesterol side chain cleavage enzyme (CYP11A1).
在哺乳动物中，类固醇激素由胆固醇经线粒体CYP11A1系统代谢生成孕烯醇酮，所需还原当量由NADPH经AdR（adrenodoxin reductase）和Adx（adrenodoxin）组成的电子传递链提供。反应伙伴通过一系列瞬时相互作用实现电子从NADPH向CYP11A1的转移。本研究比较了野生型Adx与突变体AdxS112W在...
In vitro analyses of the dysregulated R206H ALK2 kinase-FKBP12 interaction associated with heterotopic ossification in FOP.
经典进行性骨化异常（FOP）中，骨形态发生蛋白I型受体激酶ALK2/ACVR1调控亚域的单一复发突变R206H导致异位骨化。该突变仅将一个精氨酸替换为组氨酸，而组氨酸在生理pH范围内可发生质子化，因此提出pH敏感开关机制，导致突变受体在配体非依赖条件下激活BMP信号。为检验该机制中FKBP12介导的激酶自抑制是否丧失，作者用纯化的野...