组织学长期依赖苏木精-伊红（H&E）染色，但活体多光子成像尚未充分利用，因为缺乏合适的形态标记。本文报道一种遗传编码荧光形态标记 NuCyM（Nucleus, Cytosol, and Membrane），旨在活体内重现 H&E 染色模式。作者利用 ROSA26 细菌人工染色体（BAC）构建普遍表达 NuCyM 的转基因小鼠。NuC...
内吞回收货物从早期内体（EE）向内体回收区室（ERC）的定向运输依赖磷脂酰肌醇 3-磷酸（PtdIns(3)P）水解和小 GTP 酶 Rab11 的激活，但二者如何协调尚不清楚。作者开发了一种新型遗传编码 FRET 生物传感器 AS-Rab11，用于在活细胞中监测 Rab11 的核苷酸结合状态。结果显示，结合网格蛋白的磷脂酰肌醇 3...
细胞质膜离子通道活动产生对多种生物功能至关重要的电压变化，但内质网/肌浆网（ER/SR）膜在细胞活动过程中是否发生电压变化仍不明确。该问题对依赖肌浆网膜 Ca2+ 通量的功能尤为关键，例如横纹肌收缩由横小管去极化触发肌浆网膜上的兰尼碱受体 Ca2+ 释放通道开放。本研究在分化肌肉纤维中靶向表达 Mermaid 家族电压敏感荧光共振能...
布氏锥虫血液型生活阶段完全依赖葡萄糖代谢产生 ATP，该过程发生在类过氧化物酶体细胞器糖体中。许多研究关注葡萄糖摄取与代谢，但此前无法监测活寄生虫细胞和细胞器葡萄糖浓度变化。作者开发了一种非破坏性技术，利用荧光蛋白生物传感器 FLII12Pglu-700μδ6 结合流式细胞术，监测布氏锥虫细胞质和糖体葡萄糖水平。携带该传感器的寄生虫...
cAMP-PKA通路在多种生物信号转导中起核心作用，在白色念珠菌等病原真菌中与毒力相关，但光滑念珠菌中该通路的作用仍不清楚。为在活细胞中动态监测cAMP-PKA活性，作者将AKAR3和EPAC2两种FRET生物传感器转入光滑念珠菌BG2，构建由CgPGK1启动子驱动、含hphNT1标记的质粒pLDg03和pLDg04。利用CellA...
布氏锥虫引起人类非洲锥虫病，在哺乳动物宿主体内依赖葡萄糖代谢产生ATP。靶向葡萄糖摄取或调控是潜在治疗策略，但现有方法难以鉴定葡萄糖摄取与调控抑制剂。本文建立了一种基于FRET流式细胞术的高通量筛选方法，用于鉴定降低锥虫细胞质和糖体葡萄糖水平的小分子干扰物。作者将基因编码的荧光蛋白葡萄糖传感器FlII12PGlu-600µ分别表达于...
将 cAMP 生成限制在特定亚细胞位置，可使这一普遍第二信使引发独特功能反应，但决定其产生位置的因素仍不清楚。本研究考察脂质筏与非筏膜微域在成年心室肌细胞 cAMP 信号区室化中的作用。使用自由扩散的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器 Epac2-camps 测量胞质整体 cAMP 响应，并将探针靶向脂质筏（Epac2-MyrP...
组胺H3受体（H3R）激活参与记忆和认知过程，阻断H3R可延缓阿尔茨海默病、精神分裂症和嗜睡症等神经疾病进展，但目前缺乏直接检测H3R激活的方法。本文报道一种新型分子内荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，用于实时可视化H3R激活。作者将青色荧光蛋白（CFP）融合于人H3R C端，并将黄色荧光蛋白（YFP）插入第三胞内环，构建mG...
由于现有遗传编码探针存在光谱重叠，直接可视化并光控多个细胞过程具有挑战。本文报道迄今最红移的单体近红外（NIR）荧光蛋白 miRFP720，以及全近红外 Förster 共振能量转移（FRET）对 miRFP670–miRFP720，使所设计的生物传感器能够与 CFP–YFP 成像和蓝绿光遗传学工具兼容。作者开发了 Rac1 GTP...
Lin28a 是受严格调控的 RNA 结合蛋白和多能性因子，其水平控制细胞与机体生长。Lin28a 可在转录后水平被丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路磷酸化，并通过与 HIV TAR-RNA 结合蛋白（TRBP）形成磷酸化依赖的稳定化相互作用而由低基础水平上调，但该机制的分子与时空细节尚不清楚。本研究解析 Lin28a 与 TRBP...
Förster 共振能量转移（FRET）可直接观察 G 蛋白偶联受体（GPCR）激活异源三聚体 G 蛋白。本研究在人类 Gα13 亚基多个位点插入 mTurquoise2，旨在开发基于 FRET 的 Gα13 激活生物传感器。三种荧光标记 Gα13 变体因能定位于质膜并在 LPA2 受体激活后招募 p115-RhoGEF 而被认为具...
监测细胞表面酶活性具有挑战性，因为基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器在转运和膜整合方面效率较低。为此，作者开发了一种供体与受体分离、可在原位组装的混合生物传感器。通过整合定向进化与序列-功能分析，作者工程化了一种 monobody 变体 PEbody，使其能够特异性结合藻红蛋白 R-PE。PEbody 可用于可视化细胞间连...
维持蛋白质折叠稳态（proteostasis）的质量控制（QC）蛋白池具有动态性，但在人类疾病中可能耗竭。定量界定该 QC 池的深度是一个挑战。作者开发了一种新的生物传感器，并结合流式细胞术方法和数学建模，测量 QC 系统作为 holdase 结合未折叠底物以及抑制生物传感器聚集的能力。该生物传感器由一系列具有不同折叠稳定性的 ba...
FRET 生物传感器是研究活细胞内特定信号通路激活的有用工具。多数现有传感器基于强度法 FRET 设计，而荧光寿命提供更可靠的 FRET 测量。近十年来，FLIM 系统更易获得，荧光蛋白种类也大幅增加，包括长寿命绿色/青色荧光蛋白 Clover 和 mTurquoise2、红色变体 mRuby2 以及暗受体 sREACh。本研究将这...
上皮是由极化细胞通过紧密黏附连接构成的屏障，在维持组织完整性的同时需保持可塑性以完成细胞质分裂等事件。在脊椎动物中，黏附连接的重组与强化可维持上皮完整性，但紧密连接在细胞分裂中的作用尚未明确。本研究以非洲爪蟾胚胎上皮为模型，考察紧密连接在细胞质分裂中的功能。利用反义 morpholino 敲低紧密连接相关蛋白 ZO-1 和 GEF-...
酪蛋白激酶1（CK1）在多种信号转导通路中发挥核心作用，并参与众多细胞活动。长期以来，CK1被认为不依赖调节亚基、以组成型方式发挥作用。近期研究发现DEAD盒RNA解旋酶，尤其是DDX3X，可在体外刺激CK1活性。为在活细胞中观察CK1活性并研究其与DDX3X的相互作用，我们开发了一种CK1特异性FRET生物传感器。该工具显示，DD...
毒蕈碱受体（M-Rs）是 A 类 G 蛋白偶联受体，乙酰胆碱（ACh）结合跨膜螺旋束内的正构位点激活受体。激活状态下，受体功能可被结合于胞外表面的变构调节剂或膜电位调节。本研究比较 M1-R 与 M3-R 的电压调节及其化学变构调节，并利用 Gq 蛋白循环 FRET 生物传感器在单个 HEK293 细胞中定量受体信号。在 ACh 存...
肠上皮细胞构成保护机体免受病原体和膳食物质侵害的物理屏障，因此其损伤必须迅速修复。多项体内和体外研究表明细胞外信号调节激酶（Erk）参与再生过程，但 Erk 活性与组织形态相关的空间调控尚未充分阐明。本研究利用双光子显微镜和携带 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器的小鼠，在活体小鼠回肠上皮细胞中实时监测 Erk 活性...
蛋白生物传感器广泛用于监测活细胞及体外体系中的代谢物浓度和酶活性。中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase, NE）是一种与炎症疾病相关的丝氨酸蛋白酶，其活性若不受调控可导致病理状态。本研究聚焦于一种基于 Förster 共振能量转移（FRET）的 NE 活性生物传感器的结构表征。该传感器由黄色荧光蛋白（YFP）...
双相情感障碍、精神分裂症、自闭症和智力障碍等神经发育疾病严重影响数百万患者，但治疗进展受限于对分子机制认识不足。本研究通过靶向检索发现，编码330 kDa三重功能结构域（TRIO）蛋白的基因在神经发育疾病中存在新发突变富集。作者制备多种TRIO抗体，证明较小TRIO9亚型是脑内主要蛋白产物，且出生后水平下降。TRIO9含两个鸟苷酸交...