Opportunities for bioprocess monitoring using FRET biosensors.
生物过程监测用于跟踪细胞培养进程并保证产品质量。现有代谢监测主要依赖对细胞外培养基样品进行离线测量，存在时间延迟且易引入人为误差。在合成生物学时代，可以设计和实施由生物大分子组成、能够报告细胞内环境的生物传感器。荧光报告信号可实现对培养过程的无创、非破坏性在线监测，缩短测量与干预之间的延迟。本迷你综述聚焦以 Förster 共振能量...
GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk.
许多G蛋白偶联受体（GPCR）定位于初级纤毛，但纤毛对GPCR信号的功能意义仍不清楚。本研究聚焦D1多巴胺受体（D1R）和β2肾上腺素受体（B2AR），二者均通过升高环磷酸腺苷（cAMP）传递信号，但纤毛定位不同。D1R在IMCD3细胞纤毛上富集，破坏纤毛并不影响其表面表达或浓度依赖性cAMP反应。作者开发了可分辨纤毛内与纤毛外cA...
Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells.
基于 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器可用于在活细胞中以亚细胞分辨率和秒级时间尺度解析蛋白激活事件的动态过程，这些过程难以用传统生化和细胞生物学方法直接观察。本文系统介绍将 FRET 生物传感器原始图像数据转化为相对比率定量测量的基本图像处理流程，重点讨论遗传编码单链 FRET 传感器以及分子间双链设计系统的处理...
Quantitative monitoring of 2-oxoglutarate in Escherichia coli cells by a fluorescence resonance energy transfer-based biosensor.
2-氧代戊二酸（2OG）是高度保守的三羧酸循环代谢物，不仅在代谢中起关键作用，还在多种生物中作为信号分子。环境无机氮被微生物还原为铵，其代谢途径涉及2OG向谷氨酸和谷氨酰胺的转化。实时追踪2OG有助于细胞代谢与信号转导研究。本文基于荧光共振能量转移（FRET）构建了一种遗传编码的2OG生物传感器，将NifA蛋白中功能性的2OG结合域...
A fluorescence-based method for evaluating inositol 1,4,5-trisphosphate receptor ligands: determination of subtype selectivity and partial agonist effects.
肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）受体包括IP3R1、IP3R2和IP3R3三个亚型。尽管已合成多种IP3受体配体，但尚无已知亚型选择性配体。作者利用基于荧光共振能量转移（FRET）的IP3生物传感器LIBRAvI、LIBRAvII和LIBRAvIII，建立了一种简单荧光方法，用于检测IP3受体配体的亚型选择性。向表达相应生物传感器的...
Role of PTEN in modulation of ADP-dependent signaling pathways in vascular endothelial cells.
ADP在血管内皮中发挥关键信号作用，ADP受体是多种心血管药物靶点，但其细胞内调控通路尚未完全阐明。本研究鉴定了磷酸酶PTEN在ADP依赖性内皮型一氧化氮合酶（eNOS）激活以及内皮细胞脂质和蛋白激酶通路中的重要作用。我们发现，siRNA介导的PTEN敲低可增强ADP促进的eNOS激活和p38 MAPK磷酸化；然而，siRNA敲低p...
High vascular tone of mouse femoral arteries in vivo is determined by sympathetic nerve activity via α1A- and α1D-adrenoceptor subtypes.
背景与目的：活体中确定血管受体作用困难，难以通过全身拮抗或基因操作实现。本研究用活体荧光显微镜测量交感受体，尤其α1-肾上腺素能受体亚型，对小鼠股动脉收缩激活的贡献。方法：在表达MLCK钙-钙调蛋白生物传感器的小鼠中，活体荧光显微镜测定股动脉直径和细胞内钙（[Ca2+]i），并局部应用药理学试剂判断血管受体对张力性收缩和[Ca2+]...
Intravital FLIM-FRET imaging reveals dasatinib-induced spatial control of src in pancreatic cancer.
癌症侵袭与转移发生在复杂三维环境中，并受周围宿主组织与血管的反馈调控。本研究建立了一种新型活体成像方法，用于揭示抗侵袭Src抑制剂dasatinib处理后Src活性的时空调控。作者采用基于荧光寿命成像显微镜–荧光共振能量转移（FLIM-FRET）的Src生物传感器，在p53突变转基因胰腺癌小鼠模型中实时监测药物靶向效力。与传统固定终...
Persistent cAMP signaling by TSH receptors revealed by phosphodiesterase inhibition.
本文检验甲状腺刺激激素受体（TSHR）在撤除 TSH 后是否发生持续 cAMP 信号，以及该现象是否细胞类型特异。作者采用两种方法：方法 1 用化学发光免疫分析，在培养液中加入磷酸二酯酶抑制剂 IBMX，定量 30–60 min 内细胞内 cAMP 积累；方法 2 用 FRET 型细胞内 cAMP 生物传感器 YR-ICUE 连续记...
Study of endothelial cell apoptosis using fluorescence resonance energy transfer (FRET) biosensor cell line with hemodynamic microfluidic chip system.
为研究糖尿病高糖条件下内皮细胞功能障碍机制，作者开发了血流动力学微流控芯片系统。该系统将基于caspase-3的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器细胞系与可模拟血管脉动血流的微流控芯片结合，可实时、少量细胞地检测内皮细胞凋亡。HUVEC-C3细胞系稳定表达FRET传感蛋白，用于探测caspase-3激活；凋亡发生时传感细胞由绿色...
RhoA is down-regulated at cell-cell contacts via p190RhoGAP-B in response to tensional homeostasis.
乳腺上皮细胞在柔顺的三维胶原凝胶中达到张力稳态时发生导管形态发生，该过程需要下调Rho活性。本研究在T47D细胞中比较p190RhoGAP-A与p190RhoGAP-B，发现p190RhoGAP-B而非p190RhoGAP-A介导柔顺三维胶原凝胶中RhoA活性下调和导管形态发生。RhoA与p190RhoGAP-B在细胞-细胞接触位点...
Quantitative FRET imaging to visualize the invasiveness of live breast cancer cells.
基质金属蛋白酶（MMPs）可重塑肿瘤微环境并促进癌症转移。其中，膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP，MMP-14）具有促肿瘤和促转移作用，其蛋白水解活性是侵袭性肿瘤的重要可靶向生物标志物。本研究系统开发并表征了多种基于荧光共振能量转移（FRET）的高灵敏、高特异生物传感器，用于在活细胞中可视化MT1-MMP活性。经优化，AHLR-...
Chemical informatics uncovers a new role for moexipril as a novel inhibitor of cAMP phosphodiesterase-4 (PDE4).
PDE4 是十一种环核苷酸磷酸二酯酶家族之一，在介导重要环核苷酸第二信使环磷酸腺苷（cAMP）的水解降解中起关键作用。PDE4 抑制剂具有抗炎特性，但其临床应用受限于机制相关副作用，限制最大耐受剂量。为启动开发耐受性更好的 PDE4 抑制剂，我们筛查现有已批准药物的 PDE4 抑制活性。为此，我们采用高通量计算方法，识别出耐受性良好...
Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.
荧光蛋白成像技术的进步揭示了发育生物学中的多种生物过程。特别是基于荧光共振能量转移（FRET）原理的遗传编码生物传感器，已被用于在活细胞中可视化胞内信号分子的空间与时间动态。然而，高灵敏度FRET生物传感器的开发及其在发育生物学中的应用仍具挑战，限制了其广泛使用。本综述首先概述FRET生物传感器成像的一般流程与实验技巧，随后介绍FR...
Fluctuation analysis of activity biosensor images for the study of information flow in signaling pathways.
全面理解细胞信号转导需要准确测量分子通路中的信息流。过去，信息流主要依据遗传或蛋白-蛋白相互作用推断，但这些方法通常对细胞群体平均，难以捕捉仅在特定亚细胞区域短暂激活的信号通路。单细胞信号状态数据正在出现，但多为特定时间点快照或整细胞平均。蛋白活性生物传感器可在活细胞中测量信号分子的时空激活，其数据包含复杂动态信息，可沿时间和空间解...
Millisecond spatiotemporal dynamics of FRET biosensors by the pair correlation function and the phasor approach to FLIM.
本文提出一种基于波动分析的 FRET 生物传感器检测方法，用于在活细胞中同时测量蛋白质的分子流与信号活性。作者将荧光寿命成像显微镜（FLIM）的相量（phasor）分析与沿毫秒级线扫描获取的交叉对关联函数（cross-pCF）分析相结合，检测 Rho GTPase 活性（即 FRET 生物传感器信号）的空间定位，并解析该活性群体所采...
Minimum set of mutations needed to optimize cyan fluorescent proteins for live cell imaging.
青色荧光蛋白（CFP）常作为遗传编码生物传感器中的FRET供体用于活细胞成像。近期通过大规模随机突变获得了量子产率显著提高的CFP变体。本文表明，仅在ECFP中引入T65S和H148G两个突变，即可使其性能接近最优CFP，得到Aquamarine（QY=0.89，平均荧光寿命tf=4.12 ns）。Aquamarine具有优异的pH...
Using FRET to analyse signals controlling cell adhesion and migration.
细胞黏附与迁移是动态复杂过程，需要在特定亚细胞位点对信号级联进行严格时间控制。数十年来，生化方法鉴定了协调黏附、膜突起和收缩从而驱动迁移的众多信号通路，但理解这些信号如何在单个迁移细胞的不同位点内被调控，对于阐明运动过程中通路整合至关重要。荧光蛋白变体的最新进展使开发探针成为可能，利用显微镜分析单细胞中蛋白构象、激活或相互作用的局部...
Activation biosensor for G protein-coupled receptors: a FRET-based m1 muscarinic activation sensor that regulates G(q).
本文报道了一种用于测量 m1 毒蕈碱胆碱能受体（m1 AChR）激动剂激活的荧光生物传感器的设计、构建与验证。m1 AChR 是典型的 I 类 Gq 偶联受体。该传感器采用通用 FRET 设计：以循环置换的 CFP 突变体为供体，以可特异性反应荧光素 FlAsH 为受体；当完全激动剂结合时，FRET 信号降低 15%–20%。重要的...
Mining the Sinorhizobium meliloti transportome to develop FRET biosensors for sugars, dicarboxylates and cyclic polyols.
FRET生物传感器可实时检测生物重要配体，但目前仅覆盖22种化合物、8类物质。为扩展可用传感器，作者利用Sinorhizobium meliloti转运组的诱导谱系统筛选新的FRET传感器。研究开发了两种用于在FRET荧光蛋白之间克隆溶质结合蛋白（SBP）基因的新载体：除常用青色/黄色荧光蛋白（CFP/YFP）对外的pCYS载体外，...