Generation and application of signaling pathway reporter lines in zebrafish.
近年来，多种工具使生物学从简单模型层面转向更系统的科学。透明斑马鱼胚胎是重要活体模型，经报告蛋白编码基因的生殖系转化后，可在单细胞分辨率下追踪特定荧光细胞群。转化获得的转基因胚胎、幼鱼和成鱼可在特定时间和组织中开展延时分析、数字成像定量、流式细胞分选和下一代测序。这些多面遗传与细胞方法使研究者能够在亚细胞、细胞间、组织和整体动物水平...
Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.
荧光蛋白成像技术的进步揭示了发育生物学中的多种生物过程。特别是基于荧光共振能量转移（FRET）原理的遗传编码生物传感器，已被用于在活细胞中可视化胞内信号分子的空间与时间动态。然而，高灵敏度FRET生物传感器的开发及其在发育生物学中的应用仍具挑战，限制了其广泛使用。本综述首先概述FRET生物传感器成像的一般流程与实验技巧，随后介绍FR...
Vascular tone and Ca(2+) signaling in murine cremaster muscle arterioles in vivo.
本研究旨在确定麻醉小鼠骨骼肌小动脉基础血管张力的分子要求，并判断非同步钙波是否参与。作者将表达 exMLCK 或 smGCaMP2 遗传编码钙生物传感器的小鼠 cremaster 肌肉外翻，利用宽场、共聚焦和多光子显微镜观察平滑肌细胞钙信号与小动脉直径。结果显示，基础状态下小动脉张力约为 50%；局部阻断 Ang-II AT1 受体...
In vivo Wnt signaling tracing through a transgenic biosensor fish reveals novel activity domains.
在细胞迁移、分化与形态发生过程中，能够解析特定细胞信号事件在活体内时空激活的分子工具对发育细胞生物学具有重要意义。本文报道了两种用于 Wnt/β-catenin 信号通路的转基因报告品系 TCFsiam 的构建、验证与应用，并证明它们是可靠且敏感的 Wnt 生物传感器，可用于活体研究。结果显示，这些品系能在多种细胞背景下敏感检测 W...
Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor.
细胞内pH变化已被广泛认为是重要的信号机制。在植物中，质膜和液泡膜上的质子泵对维持胞内pH稳态及跨膜质子梯度起关键作用。为实时追踪外部刺激下pH在空间和时间上的精细变化，作者开发了一种新型遗传编码生物传感器pHusion。pHusion由增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与单体红色荧光蛋白（mRFP1）串联融合而成，可作为比率型pH传感...
In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals.
体内生物发光成像（BLI）正日益成为现代生物学研究的重要方法。该技术利用表达荧光素酶的生物报告细胞发出的光，对活体动物进行非侵入式检测，已广泛应用于基因功能、药物发现与开发、细胞迁移、蛋白-蛋白相互作用，以及肿瘤发生、癌症治疗与疾病进展等生物分子过程研究。本文综述了BLI与多种生物报告/生物传感系统的整合方式，讨论了不同荧光素酶报告...
Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors.
基于荧光共振能量转移（FRET）的分子生物传感器是研究活细胞中蛋白活性的重要工具，但因其固有的细胞复杂性和三维成像挑战，很少用于完整生物体。本文提供在早期发育中使用单链分子内 FRET 生物传感器的实验方案，给出胚胎 FRET 比值成像的通用流程，包括数据采集条件和比值图像生成算法。作者以 pRaichu RacFRET 生物传感器...
In vivo imaging of cell behaviors and F-actin reveals LIM-HD transcription factor regulation of peripheral versus central sensory axon development.
神经元特定形态的建立需要精确调控轴突形成、延伸和分支等细胞运动过程，而丝状肌动蛋白（F-actin）细胞骨架的动态重塑是这些过程的核心，但其在完整胚胎体内的调控机制仍不清楚。斑马鱼Rohon-Beard（RB）感觉神经元具有中枢轴突和外周轴突两种不同轨迹，LIM同源域（LIM-HD）转录因子活性对外周RB轴突形成必不可少。本研究利用...
In vivo assessment of artery smooth muscle [Ca2+]i and MLCK activation in FRET-based biosensor mice.
控制动脉直径的细胞机制在高血压中仍不明确。本文报道一种方法，可在1.5%异氟烷麻醉的活鼠中同时记录动脉平滑肌细胞内钙浓度（[Ca2+]i）、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）激活分数和动脉外径，并与动脉血压同步。该方法还能评估局部受体活性对[Ca2+]i、MLCK活性和直径的影响，而不受全身效应干扰。研究使用在平滑肌中表达钙/钙调蛋白激活...
Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in zebrafish embryos.
斑马鱼是活体观察发育过程中细胞行为的理想模型。其体外受精使胚胎各发育阶段均易于操作，光学透明性则允许在完整胚胎自然环境中高分辨率成像细胞与分子动态。本文采用活体成像方法分析神经嵴细胞迁移以及神经元轴突生长和引导过程中的细胞行为。活体成像有助于理解调控细胞运动机制；为观察突起活动和分子动态等细节，标记单个细胞具有优势。在斑马鱼中，质粒...
Autofluorescent proteins with excitation in the optical window for intravital imaging in mammals.
荧光蛋白已成为生物医学研究中重要的蛋白标签、基因表达报告分子、生物传感器组分和细胞谱系追踪工具。然而，由于血红蛋白对 600 nm 以下激发光的强吸收，哺乳动物深组织活体成像受到限制，因此需要能在 600 nm 以上“光学窗口”内有效激发的荧光蛋白。本文通过定点突变和随机突变定向进化，从 Discosoma 和 Entacmaea ...
A novel BRET-based genetically encoded biosensor for functional imaging of hypoxia.
光学成像方法，尤其是荧光成像，因荧光蛋白的广泛应用而成为监测癌症等生物过程的重要手段。然而，绿色荧光蛋白（GFP）等常用探针在活体中易受内源性荧光团吸收激发光引起的自荧光和信号弥散影响，限制其作为体内示踪剂的适用性。近年来，近红外荧光蛋白的发展使实时成像可避免自荧光干扰并实现更深层组织观察。为此，作者设计了一种由新生血管相关转录因子...