游离烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是NAD+消耗酶的底物，其局部浓度可影响PARP/ARTD和sirtuin等酶活性。本章介绍利用基因编码荧光生物传感器测量亚细胞区室NAD+浓度的方法，并讨论该传感器的局限性与潜在应用。内容包括：（1）基于磁珠的方法校准仪器与实验装置；（2）在细胞中设置必要对照并正确进行比率荧光测量；（3）采用适...
突变报告系统是量化基因组稳定性的重要工具，但现有方法多依赖细胞存活或死亡来区分突变细胞，通常需要数天至数周，且受细胞类型和细胞毒性试剂限制，难以评估急性或时间依赖的突变变化。作者基于 mCherryFP 荧光依赖 Trp98 残基的发现，将该位点密码子 TGG 替换为终止密码子 TGA，构建突变激活型荧光生物传感器 CherryOF...
布氏锥虫血液型生活阶段完全依赖葡萄糖代谢产生 ATP，该过程发生在类过氧化物酶体细胞器糖体中。许多研究关注葡萄糖摄取与代谢，但此前无法监测活寄生虫细胞和细胞器葡萄糖浓度变化。作者开发了一种非破坏性技术，利用荧光蛋白生物传感器 FLII12Pglu-700μδ6 结合流式细胞术，监测布氏锥虫细胞质和糖体葡萄糖水平。携带该传感器的寄生虫...
布氏锥虫引起人类非洲锥虫病，在哺乳动物宿主体内依赖葡萄糖代谢产生ATP。靶向葡萄糖摄取或调控是潜在治疗策略，但现有方法难以鉴定葡萄糖摄取与调控抑制剂。本文建立了一种基于FRET流式细胞术的高通量筛选方法，用于鉴定降低锥虫细胞质和糖体葡萄糖水平的小分子干扰物。作者将基因编码的荧光蛋白葡萄糖传感器FlII12PGlu-600µ分别表达于...
维持蛋白质折叠稳态（proteostasis）的质量控制（QC）蛋白池具有动态性，但在人类疾病中可能耗竭。定量界定该 QC 池的深度是一个挑战。作者开发了一种新的生物传感器，并结合流式细胞术方法和数学建模，测量 QC 系统作为 holdase 结合未折叠底物以及抑制生物传感器聚集的能力。该生物传感器由一系列具有不同折叠稳定性的 ba...
关于突变亨廷顿蛋白外显子1（Httex1）包涵体形成与毒性关系存在两种竞争模型：包涵体通过隔离可溶性蛋白毒性而具有适应性，或包涵体通过共聚集蛋白组损害细胞功能。作者利用哺乳动物细胞模型中的Httex1构象生物传感器，发现一种可调和上述模型的机制。新形成的包涵体主要由无序Httex1和核糖核蛋白组成；随着包涵体成熟，Httex1重排为...
溶酶体pH稳态对细胞生理功能至关重要，开发用于溶酶体成像和比率pH测量的小型荧光纳米传感器具有重要需求但颇具挑战。本文利用pH敏感荧光素（FAM）标记的AS1411适配体，通过交联剂Sulfo-SMCC共价修饰无标记荧光硅纳米点（SiNDs），构建了一种比率型pH生物传感器。该适配体传感器具有超小尺寸、低毒性、良好的pH可逆性和光稳...
条带模式成像流式细胞术用于稀有细胞检测时，需用 CCD 相机以视频方式采集运动荧光标记细胞，细胞运动轨迹形成条带，其长度与曝光时间成正比。动态成像条件带来高背景噪声等检测难题，尤其在使用低分辨率网络摄像头或智能手机相机进行床旁检测（POCT）时难以准确计数。为此，作者提出一种“计算生物传感器”，将生物传感硬件与计算算法结合，对硬件捕...
钙离子（Ca2+）介导的信号转导是真核生物中保守的调控机制，也存在于人类疟疾病原体恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）中。由于疟原虫体积小于10 μm，其胞内Ca2+测量在技术上具有挑战性，因此该病原体中Ca2+调控机制尚不清楚。本研究采用表达黄色变色龙（yellow cameleon, YC）-Nano Ca2...
30多年前，含GGDEF结构域的酶被证明是二鸟苷酸环化酶，可产生环二鸟苷酸（cdiG），后者作为第二信使调控细菌从运动状态向定殖生物膜状态的转变。此后，GGDEF蛋白基因在细菌基因组中广泛存在，确立了cdiG信号在细菌中的主导地位。然而，变形菌编码大量GGDEF蛋白，某些情况下接近编码序列的1%，这引发细菌为何需要如此多GGDEF酶...
本文报道一种基于荧光共振能量转移（FRET）的信号开启型分裂适配体生物传感器，用于高灵敏、高特异检测肿瘤细胞。早期肿瘤患者血液中肿瘤细胞数量少，且复杂基质和细胞内吞易造成高背景，限制现有方法灵敏度与特异性。作者利用 cell-SELEX 筛选的适配体 ZY11，将其茎区切割为 Split A 和 Split B，并分别在 3' 端标...
荧光激活蛋白（FAP）是一类新型生物传感器，可特异性结合小分子荧光原，并在结合后使其量子产率从接近0升至约0.5，从而实现高灵敏度荧光检测。与绿色荧光蛋白不同，FAP在未结合荧光原时不发光，因此适合活细胞中受体转运的实时监测。作者将FAP检测平台与高通量流式细胞术结合，对约34万种化合物进行筛选，发现一类能干扰荧光原与FAP结合、从...
线粒体功能障碍与多种人类疾病及正常衰老相关，其稳态依赖线粒体自噬（mitophagy）介导的受损线粒体向溶酶体转运与降解。线粒体自噬依赖巨自噬（macroautophagy），但本身是选择性过程，可在特定条件下与巨自噬解耦，因此需同时并分别评估两者。作者开发了一种基于流式细胞术（FCM）的高通量定量方法，利用单一荧光蛋白生物传感器 ...
水安全是公共卫生和自然环境保存的重大关切。本文提出利用噬菌体开发能够检测水中人和动物病原体的生物传感器工具。为此，作者利用噬菌体的高度区分性，使其特异性感染细菌宿主。关键挑战在于使用荧光报告蛋白，该蛋白只有在基因改造温和噬菌体与其细菌宿主发生特异性识别后才合成并被检测。为保证准确性和执行速度，作者开发了无需细菌生长的检测流程，仅需1...
环二鸟苷酸（c-di-GMP）是细菌第二信使，传递内外信号并调控运动性与生物膜形成。许多细菌编码上百种 c-di-GMP 调节酶，但只有少数酶的活性信号被明确。作者开发并应用一种高通量、实时流式细胞术方法，利用基于荧光共振能量转移（FRET）的游离 c-di-GMP 生物传感器，在鼠伤寒沙门氏菌中筛选能调节其浓度的信号。该方法鉴定出...
开发荧光生物传感器的主要动机是实时监测细胞内代谢物水平。大多数可遗传编码的荧光传感器基于受体蛋白与荧光蛋白结构域的融合，但许多小分子代谢物缺乏已知蛋白受体，且基于蛋白受体的FRET传感器工程化困难。近年来，小分子结合核糖开关通过与体外筛选的Spinach适配体融合，被改造为荧光生物传感器；Spinach可结合前荧光、细胞可渗透的GF...
我们开发了一种在活细胞中区分不同蛋白构象的新方法——可暴露四半胱氨酸（XTC）。该方法将工程化四半胱氨酸基序引入目标蛋白，使其根据构象状态有条件地暴露于双砷染料结合。XTC用于区分Src家族激酶的开放与关闭调控构象。仅在c-Src、Lck和Lyn三个Src家族激酶保守SH2域中将四个残基替换为半胱氨酸，即可基于与双砷染料FlAsH或...
本文报道了一种用于检测纯化酶及无细胞提取物中碱基切除修复（BER）活性的新型多重检测方法。该方法首先通过快速且原创的程序，用荧光染料 Alexa 488 对磁性微珠进行编码，形成可区分的荧光条形码。随后，将含有 DNA 损伤位点的 DNA NanoBeacons（NBs）固定到荧光编码微珠表面；这些探针标记有 Cyanine 5（C...
同时监测活细胞内多种蛋白的转运具有重要价值，因为许多受体蛋白在同一细胞中协同发挥作用，但现有荧光标记技术限制了功能受体对的机制研究。作者将荧光激活蛋白（FAP）技术与高通量流式细胞术结合，发展出一种稳健、灵敏且通用的新型生物传感器，用于在同一细胞中研究多种转运蛋白。该模型系统采用与人β2肾上腺素受体（b2AR）融合的FAP AM2....
本文开发了一种基于纳米颗粒共价修饰抗人上皮细胞黏附分子（EpCAM）单克隆抗体的敏感、选择性传感器，用于检测结肠癌细胞。透射电镜（TEM）图像表明，纳米颗粒及功能化纳米颗粒具有良好的分散性，适用于应用。采用高碘酸钠（NaIO4）氧化法氧化抗体，以将抗体共价固定于硅包覆荧光纳米颗粒表面，该方法能很好地保持抗体活性。荧光显微镜成像和流式...