本文提出一种基于波动分析的成像方法，用于定量研究蛋白寡聚化如何调节多功能蛋白的信号活性。作者以 Rac1 FRET 生物传感器为对象，在活细胞中记录荧光寿命成像（FLIM）数据，并使同一数据格式同时支持相位（phasor）分析与交叉 Number and Brightness（cN&B）分析。通过该方法，可测量 Rac1 传感器在细...
在生物传感器中，遗传编码的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器被广泛用于在活细胞或组织中定位并测量酶活性。激酶活性尤其重要，因为其时空调控对理解细胞命运决定至关重要；ERK 是信号转导通路中的关键节点，可引导细胞进入不同生理过程。为在体内分析激酶并检测其活性的细微变化，需要更好的工具。本文报道了对先前 ERK 活性报告分子 EKA...
本章首先简要介绍荧光与荧光共振能量转移（FRET）的基本原理，随后重点讨论记录FRET最常用的方法，尤其关注广泛用于生物传感器成像的显微镜技术。文中比较了宽场荧光显微镜与激光扫描共聚焦显微镜的仪器选择，说明基于强度（如比率成像、受体光漂白）和基于供体荧光寿命（FLIM）的FRET检测方式，并给出将特定记录方法与具体科学实验相匹配的指...
正确纺锤体组装和染色体分离依赖精确的微管动态，部分由kinesin-13 MCAK调控。Aurora B依赖磷酸化可抑制MCAK的微管去聚合活性，但机制不明。本文开发了首个用于MCAK的FRET生物传感器，显示溶液中MCAK通过C端结构域（CT）与neck相互作用而处于闭合构象。荧光寿命成像（FLIM）表明，结合微管末端的MCAK相...
本论文报道了一种用于在单细胞内直接监测驱动蛋白-2家族马达KIF17活性的FRET生物传感器。KIF17通过调节微管动态和组织促进上皮分化，但其活性如何受时空调控尚不清楚。多种驱动蛋白包括KIF17可采取紧凑和伸展构象，分别对应自抑制和活性状态。作者构建了全长KIF17两端分别融合mCherry和Emerald GFP的表达载体，利...
基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码比率型生物传感器是研究细胞信号时空动态的有力工具，但许多传感器灵敏度不足。本文报道了一个生物传感器库，其中供体和受体荧光蛋白均包含循环置换突变体，改变偶极取向，从而在保持 FRET 效率的同时更好地适应不同信号分子施加的结构约束。该策略提高了已有 RhoA 和细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）...
癌症侵袭与转移发生在复杂三维环境中，并受周围宿主组织与血管的反馈调控。本研究建立了一种新型活体成像方法，用于揭示抗侵袭Src抑制剂dasatinib处理后Src活性的时空调控。作者采用基于荧光寿命成像显微镜–荧光共振能量转移（FLIM-FRET）的Src生物传感器，在p53突变转基因胰腺癌小鼠模型中实时监测药物靶向效力。与传统固定终...
双光子激光扫描显微镜可揭示活体动物深部组织中细胞运动与相互作用，但现有成像技术难以阐明器官功能障碍的分子基础。Förster 共振能量转移（FRET）是探测细胞功能分子机制的重要工具，而荧光寿命成像（FLIM）作为无校准方法，更适合在活体内定量 FRET，其主要限制是深部组织三维/四维成像中的采集速度。本文提出一种并行化时间相关单光...
Laurdan 的荧光特性已被证明是研究模型膜和活细胞膜堆积及有序脂质相的有效工具。传统上，Laurdan 发射光谱从有序脂质相的蓝色向无序脂质相的绿色移动，通过广义极化（GP）函数定量。本文研究 Laurdan 在两个不同发射波长下的荧光寿命，发现当将其发射的偶极弛豫在光谱上分离后，荧光衰减分析能够区分膜流动性变化与胆固醇含量变化...
许多癌症存在蛋白激酶活性失调，但并非都对抑制剂敏感，部分原因在于复杂组织中磷酸化动态尚不清楚。活细胞亚细胞分析可揭示混合细胞群体中激酶信号细节。现有原位激酶活性成像工具多依赖荧光强度或 Förster 共振能量转移（FRET），易受光谱串扰和光漂白影响。本文报道一种基于荧光寿命成像显微镜（FLIM）的细胞穿透肽生物传感器，用于动态监...
细胞黏附与迁移是动态复杂过程，需要在特定亚细胞位点对信号级联进行严格时间控制。数十年来，生化方法鉴定了协调黏附、膜突起和收缩从而驱动迁移的众多信号通路，但理解这些信号如何在单个迁移细胞的不同位点内被调控，对于阐明运动过程中通路整合至关重要。荧光蛋白变体的最新进展使开发探针成为可能，利用显微镜分析单细胞中蛋白构象、激活或相互作用的局部...
功能成像可提供传统高内涵筛选难以达到的定量水平，因为现有高内涵系统多将单细胞表型分析放大，指标偏图像化且较主观。本文开发并验证了一种结合稳态荧光各向异性成像与荧光寿命成像（FLIM）的原型高内涵筛选平台，用于蛋白质-蛋白质相互作用检测中的小分子库客观定量筛选。作者介绍了仪器开发，并说明如何从宽场受体荧光各向异性成像中提取荧光共振能量...
本文提出基于荧光寿命成像显微镜（FLIM）的相量（phasor）方法用于生物传感器 Förster 共振能量转移（FRET）检测，并证明该方法对生物传感器设计以及细胞环境中固有的荧光伪影具有稳健性。作者以一系列双链和单链 GTPase 生物传感器为对象，这些传感器用于报告 Rac1 和 RhoA 活性的亚细胞定位；同时对所获得的 F...
机械力已知可调节Jun N端激酶（JNK）信号级联，但此前对机械应力激活JNK的分析主要依赖体外检测方法，活细胞中JNK如何响应机械应力及其功能仍不清楚。本研究利用荧光寿命成像显微镜（FLIM）和分子内磷酸化依赖的dJun-FRET生物传感器，实时评估果蝇S2R+细胞中JNK通路活性。定量FRET-FLIM分析与共聚焦显微镜显示，机...
自然杀伤（NK）细胞通过运动、识别和定向分泌等依赖细胞骨架重排的过程杀伤肿瘤和病毒感染细胞。Rho GTPase Cdc42 协调多种受体下游的细胞骨架重组。作者假设 NK 细胞与靶细胞相互作用时 Cdc42 活性可能发生振荡。利用 Cdc42 荧光共振能量转移（FRET）生物传感器和荧光寿命成像（FLIM），在活 YTS NK 细...
微管亲和力调节激酶（MARK）/Par-1 家族蛋白激酶在细胞极性建立、细胞周期调控和胞内信号转导中发挥重要作用，其功能紊乱与癌症及脑疾病（如无脑回畸形和阿尔茨海默病）相关。为阐明 MARK 家族激酶的生物学作用，作者筛选特异性抑制剂并开发 MARK 活性生物传感器。对约 18000 个化合物的 ChemBioNet 库进行筛选，获...
荧光寿命分辨成像显微镜（FLIM）已被用于监测蛋白水解酶膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）的酶活性，该酶参与细胞外基质蛋白降解及细胞迁移等过程，其表达升高与肿瘤细胞侵袭潜能正相关。本文利用一种基于 Förster 共振能量转移（FRET）的基因编码生物传感器，在体外及活 HeLa 和 HT1080 细胞中检测 MT1-MMP 的...
表面修饰是功能化微/纳结构的重要方法，但现有研究主要局限于坚固的无机化合物基底。本文报道了一种简便方法，用于修饰脆弱的有机一维微结构表面。作者将体相分子与表面修饰剂设计为具有正交溶解度，从而在反应条件下保护分子晶体不被破坏。作为概念验证，通过异相 SN2 反应将红色发色团接枝到自组装蓝色发光微线表面，获得白光发射的一维微结构。荧光寿...
跨内皮迁移（TEM）是白细胞从血管进入组织的受调控过程，Rho GTP 酶参与该过程，但各成员贡献不明。本研究用 RNA 干扰筛选鉴定影响 T 细胞 TEM 的 Rho GTP 酶，证明 RhoA 对该过程至关重要。RhoA 缺失导致迁移极性丧失：细胞缺乏前缘和尾足结构，转而形成稳定的窄突起，且突起与收缩事件去极化分布。通过成像 R...
理解细胞功能常需对复杂胞内通路进行定量描述。荧光寿命成像显微镜（FLIM）结合 Förster 共振能量转移（FRET）分子生物传感器的发展，使活细胞内生化活性的精确测量成为可能。本文讨论如何将定量活体成像与体外生化表征相结合，建立用于模拟生化网络行为的计算系统模型，并以有丝分裂纺锤体组装中 Ran GTPase 功能的计算建模为例...