乳腺上皮细胞在柔顺的三维胶原凝胶中达到张力稳态时发生导管形态发生，该过程需要下调Rho活性。本研究在T47D细胞中比较p190RhoGAP-A与p190RhoGAP-B，发现p190RhoGAP-B而非p190RhoGAP-A介导柔顺三维胶原凝胶中RhoA活性下调和导管形态发生。RhoA与p190RhoGAP-B在细胞-细胞接触位点...
基质金属蛋白酶（MMPs）可重塑肿瘤微环境并促进癌症转移。其中，膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP，MMP-14）具有促肿瘤和促转移作用，其蛋白水解活性是侵袭性肿瘤的重要可靶向生物标志物。本研究系统开发并表征了多种基于荧光共振能量转移（FRET）的高灵敏、高特异生物传感器，用于在活细胞中可视化MT1-MMP活性。经优化，AHLR-...
全面理解细胞信号转导需要准确测量分子通路中的信息流。过去，信息流主要依据遗传或蛋白-蛋白相互作用推断，但这些方法通常对细胞群体平均，难以捕捉仅在特定亚细胞区域短暂激活的信号通路。单细胞信号状态数据正在出现，但多为特定时间点快照或整细胞平均。蛋白活性生物传感器可在活细胞中测量信号分子的时空激活，其数据包含复杂动态信息，可沿时间和空间解...
本文提出一种基于波动分析的 FRET 生物传感器检测方法，用于在活细胞中同时测量蛋白质的分子流与信号活性。作者将荧光寿命成像显微镜（FLIM）的相量（phasor）分析与沿毫秒级线扫描获取的交叉对关联函数（cross-pCF）分析相结合，检测 Rho GTPase 活性（即 FRET 生物传感器信号）的空间定位，并解析该活性群体所采...
青色荧光蛋白（CFP）常作为遗传编码生物传感器中的FRET供体用于活细胞成像。近期通过大规模随机突变获得了量子产率显著提高的CFP变体。本文表明，仅在ECFP中引入T65S和H148G两个突变，即可使其性能接近最优CFP，得到Aquamarine（QY=0.89，平均荧光寿命tf=4.12 ns）。Aquamarine具有优异的pH...
本文报道了一种用于测量 m1 毒蕈碱胆碱能受体（m1 AChR）激动剂激活的荧光生物传感器的设计、构建与验证。m1 AChR 是典型的 I 类 Gq 偶联受体。该传感器采用通用 FRET 设计：以循环置换的 CFP 突变体为供体，以可特异性反应荧光素 FlAsH 为受体；当完全激动剂结合时，FRET 信号降低 15%–20%。重要的...
FRET生物传感器可实时检测生物重要配体，但目前仅覆盖22种化合物、8类物质。为扩展可用传感器，作者利用Sinorhizobium meliloti转运组的诱导谱系统筛选新的FRET传感器。研究开发了两种用于在FRET荧光蛋白之间克隆溶质结合蛋白（SBP）基因的新载体：除常用青色/黄色荧光蛋白（CFP/YFP）对外的pCYS载体外，...
膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）是一种膜锚定胶原酶，主要参与细胞外基质蛋白的机械降解，并在多种癌症中上调，其迁移与侵袭中的协调功能仍不清楚。本文利用一种特异性识别MT1-MMP的细胞内Förster共振能量转移（FRET）生物传感器，对侵袭性HT-1080活细胞进行成像。该传感器由MT1-MMP特异性底物与mOrange2和m...
Ras/Raf/MEK/ERK 是保守信号通路，ERK1/2 是垂体功能受多种胞外信号调控的整合点。作者此前发现 GTP 酶 Ras 和 Rap1 在 EGF 或 cAMP 依赖性神经肽 VIP 调控 ERK1/2 依赖的催乳素转录中起关键作用。本研究在垂体 GH4C1 细胞系中使用基于 FRET 的 ERK 活性生物传感器 EKA...
遗传编码的Förster共振能量转移（FRET）传感器是现代细胞生物学的重要工具，其构象变化会改变供体-受体发射比，从而在时间和空间上监测靶分子变化及酶活性。FRET传感器广泛用于追踪磷酸化事件和钙离子升高。本文首次将体外与细胞内FRET测量和小角X射线散射（SAXS）相结合，在低分辨率水平上分析传感器功能相关的构象变化。研究系统表...
环磷酸腺苷（cAMP）是多种G蛋白偶联受体（GPCR）的第二信使，也是评价GPCR特异性配体生物活性的有用读出分子。本文报道了一种基于Förster共振能量转移（FRET）的cAMP生物传感器Epac2-camps，并将其与杆状病毒BacMam转导系统相结合。所构建的BacMam-Epac2-camps病毒转导系统可简便、稳健地在多...
蛋白激酶A（PKA）是细胞信号转导的关键调控酶，可磷酸化多种靶蛋白，并被A-激酶锚定蛋白（AKAP）家族在空间上锚定。AKAR2是一种活细胞FRET生物传感器，当被PKA磷酸化时产生荧光共振能量转移信号。AKAP5是AKAP家族重要成员，可锚定PKA、磷酸二酯酶PDE4D及G蛋白偶联受体（GPCR），并介导GPCR向ERK1/2的M...
免疫球蛋白E（IgE）介导过敏反应，其Fc区与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面高亲和受体FcεRI的结合是过敏致敏与细胞激活的关键步骤。为在溶液中监测人IgE Fc（IgEFc）的构象及其受体结合时的变化，作者构建了基于Förster共振能量转移（FRET）的荧光生物传感器，将增强绿色荧光蛋白（eGFP）和单体红色荧光蛋白（mRFP）分别...
分子氧（O2）是所有专性和兼性需氧原核及真核生物的关键代谢物，在能量稳态中起核心作用；缺氧则广泛影响多种生理和病理生理过程。因此，实时监测细胞内氧水平是分析活细胞和组织中缺氧诱导过程的基本前提。本研究开发了一种遗传编码的 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器，用于观察活细胞内分子氧浓度的动态变化。该传感器命名为 Flu...
成骨细胞在负载驱动骨形成中起关键作用，可通过骨细胞机械传感信号激活 Wnt 通路，但其对机械刺激的响应及小 GTPase RhoA 在机械转导中的作用尚不清楚。本研究以 MC3T3-E1 成骨样细胞为模型，在 10 dyn/cm² 单向流体剪切应力处理 1 h 条件下，检验 RhoA 信号是否介导细胞对流动剪切应力的响应。通过全基因...
本研究利用组成性表达 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器的 Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞，实时监测上皮囊泡形成过程中 Rac1 的时空活性。作者将传统 Raichu 探针中的 CFP 替换为 TFP1，降低与 GFP 序列同源导致的基因组内重组，从而建立稳定表达 Raichu-Rac1、Raichu-...
本文提供了在单通道和多通道成像模式下对Rho家族GTPase生物传感器进行活细胞成像的实验程序。多通道方法可在单个活细胞中直接同时可视化两种生物传感器读数。作者以基于CFP/YFP FRET的RhoA生物传感器和基于溶剂极性敏感有机染料的Cdc42生物传感器为例，系统列出实现双比率型生物传感器成像所需的光学组件、滤光片、二向色镜、分...
机械力已知可调节Jun N端激酶（JNK）信号级联，但此前对机械应力激活JNK的分析主要依赖体外检测方法，活细胞中JNK如何响应机械应力及其功能仍不清楚。本研究利用荧光寿命成像显微镜（FLIM）和分子内磷酸化依赖的dJun-FRET生物传感器，实时评估果蝇S2R+细胞中JNK通路活性。定量FRET-FLIM分析与共聚焦显微镜显示，机...
自然杀伤（NK）细胞通过运动、识别和定向分泌等依赖细胞骨架重排的过程杀伤肿瘤和病毒感染细胞。Rho GTPase Cdc42 协调多种受体下游的细胞骨架重组。作者假设 NK 细胞与靶细胞相互作用时 Cdc42 活性可能发生振荡。利用 Cdc42 荧光共振能量转移（FRET）生物传感器和荧光寿命成像（FLIM），在活 YTS NK 细...
基于荧光蛋白（FP）的分子内 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器可在活细胞中可视化多种生化事件。构建此类传感器需要在两种不同颜色 FP 之间插入经过选择的分子识别元件。当识别元件与目标分析物相互作用并发生构象变化时，由于 FRET 效率改变，构建体的比率发射信号发生变化。此类传感器的灵敏度与比率发射变化成正比，因此迫...