肌动蛋白丝阵列在生物和非生物刺激下重塑，需要精确调控丝端生成与可用性。异源二聚体端帽蛋白（CP）是丰富的丝端帽蛋白，其活性在体外可被膜信号磷脂抑制。为解析 CP 在细胞内如何调控丝端性质及其活性是否受磷脂协调，作者直接观察拟南芥表皮细胞皮层阵列中单个丝端的动态行为，分析 CP 对肌动蛋白组织与动态的调控，以及信号磷脂磷脂酸（PA）的...
可逆氧化是蛋白酪氨酸磷酸化调控的重要机制。生长因子刺激后产生的过氧化氢（H2O2）被认为可抑制蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）活性，从而使蛋白酪氨酸激酶（PTK）提高蛋白酪氨酸磷酸化稳态水平，推动信号传播。然而，H2O2对酪氨酸磷酸化信号动力学的影响，尤其在活细胞中，仍不清楚。本研究采用基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码Src激酶...
本文报道了一种基于碳量子点（CQDs）双发射纳米杂化材料的比率荧光传感器，用于活细胞内铜离子（Cu2+）的成像与检测。作者将 Cu2+ 特异性识别分子 N-(2-氨基乙基)-N,N,N’-三(吡啶-2-基甲基)乙烷-1,2-二胺（AE-TPEA）偶联到由 CQDs 和 CdSe/ZnS 量子点（QDs）组成的 CdSe@C 纳米杂化...
去甲基化药物可诱导癌细胞中异常沉默的抑癌基因去甲基化并重新激活，但也可能导致重复元件甲基化丢失等潜在有害效应。为观察与重复DNA去甲基化相关的药物不良效应，作者开发了一种可在活细胞中通过发光报告DNA可及性变化的新型生物传感器。该传感器由两个独立模块组成，每个模块均包含多指锌指结构域、半intein结构域和分裂荧光素酶结构域；当两个...
肿瘤信号转导通路的组成分子是抗癌药物的重要靶点。尽管已有大量关于这些分子性质的知识，但信号分子在活细胞中的时空调控仍不清楚。基于荧光共振能量转移（FRET）原理的生物传感器已被开发用于在活细胞中可视化信号分子活性。然而，高灵敏度FRET生物传感器开发困难，限制了其在癌症研究中的广泛应用；缺乏稳定表达FRET生物传感器的细胞系也制约了...
本文提供了在单通道和多通道成像模式下对Rho家族GTPase生物传感器进行活细胞成像的实验程序。多通道方法可在单个活细胞中直接同时可视化两种生物传感器读数。作者以基于CFP/YFP FRET的RhoA生物传感器和基于溶剂极性敏感有机染料的Cdc42生物传感器为例，系统列出实现双比率型生物传感器成像所需的光学组件、滤光片、二向色镜、分...
本文提出基于荧光寿命成像显微镜（FLIM）的相量（phasor）方法用于生物传感器 Förster 共振能量转移（FRET）检测，并证明该方法对生物传感器设计以及细胞环境中固有的荧光伪影具有稳健性。作者以一系列双链和单链 GTPase 生物传感器为对象，这些传感器用于报告 Rac1 和 RhoA 活性的亚细胞定位；同时对所获得的 F...
细胞周期依赖性激酶（CDK）在协调细胞生长与分裂及维持癌细胞增殖中起核心作用，是重要药物靶点。然而，目前缺乏直接评估活细胞中 CDK 相对丰度的方法，现有手段主要依赖固定细胞的抗原检测和蛋白质组分析。为直接探测这些激酶，作者开发了一种荧光肽生物传感器 CDKSENS。该传感器在体外对 CDK 和周期蛋白具有双配体亲和力，可保留细胞裂...
细胞信号转导发生在复杂且冗余的相互作用网络中，最理想的研究方式是在同一活细胞中同步监测多个组分的激活动态。近年来，生物传感器技术的进展使人们能够在同一活细胞内可视化并定量多个网络节点的激活状态。遗传编码的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器、正交荧光蛋白对以及荧光寿命成像显微镜（FLIM）显著提高了实验多重化的能力，使两个甚至三个...
NADH 是电子传递中的关键代谢辅因子，但在活细胞胞质中对其进行敏感、特异检测一直困难。作者将环化置换绿色荧光蛋白 T-Sapphire 与细菌 NADH 结合蛋白 Rex 结合，构建了胞质 NADH-NAD+ 氧化还原状态的荧光生物传感器。初始构建报告 [NADH]×[H+]/[NAD+]，通过定点突变消除其 pH 敏感性。工程化...
活细胞荧光生物传感器通常需要繁琐优化，且依赖具有合适靶标特异性的天然配体。本文报道了一种基于工程化纤连蛋白III型单体（FN3 monobody）支架的荧光生物传感器，可通过高通量筛选改造为结合不同靶标的探针。作者以特异性识别激活态Src家族激酶（SFK）的monobody 1F11为基础，在其表面连接一种亮的环境敏感荧光染料，使染...
荧光寿命分辨成像显微镜（FLIM）已被用于监测蛋白水解酶膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）的酶活性，该酶参与细胞外基质蛋白降解及细胞迁移等过程，其表达升高与肿瘤细胞侵袭潜能正相关。本文利用一种基于 Förster 共振能量转移（FRET）的基因编码生物传感器，在体外及活 HeLa 和 HT1080 细胞中检测 MT1-MMP 的...
Rab5是受体介导内吞的关键调节因子，参与货物受体内化、内体成熟、内化信号分子的转导与降解以及受体循环。细胞应激可升高Rab5活性，且Rab5活性异常与多种疾病相关。现有抗体成像方法只能检测总Rab5，无法区分活性Rab5，也难以提供Rab5激活幅度和持续时间的动态信息。本文报道一种新型Rab5活性荧光生物传感器（RAFB），其由R...
葡萄糖代谢的第一步是己糖激酶（HKs）将葡萄糖磷酸化为葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）。HKI 主要结合线粒体，HKII 可分布于线粒体和胞质。本研究在 CHO 细胞中表达 HKI-YFP 和 HKII-YFP，同时用基于 FRET 的细胞内葡萄糖生物传感器 FLIPglu-600 mM 监测葡萄糖处理，并用 GFP 标记的糖原相关蛋...
甲状旁腺激素（PTH）通过破坏钠依赖性磷酸盐转运体2A（Npt2a）与钠-氢交换调节因子1（NHERF-1）的结合，抑制肾近端小管磷酸盐重吸收，该过程由蛋白激酶C（PKC）激活启动。为阐明动态事件顺序，作者在活体袋狸肾细胞（OK cells）中研究其时间过程。利用FRET生物传感器发现，PTH可在数秒至数分钟内激活细胞内PKC。在表...
膜筏是富含鞘脂和胆固醇的质膜微区，其中动态排列多种信号蛋白。cAMP/蛋白激酶A（PKA）通路的多个组分，包括β-肾上腺素受体（β-AR）、G蛋白和腺苷酸环化酶（AC），在膜筏与非筏区域呈差异定位。由于PKA参与调控多种基本细胞功能，且许多功能依赖膜筏，理解PKA活性如何被这些质膜微区特异性调节具有重要意义。为此，作者开发了改进的F...
环磷酸腺苷（cAMP）调控多种生物学过程与细胞功能，其胞内空间梯度日益受到重视。既往研究表明，巨噬细胞吞噬过程中会产生cAMP，且cAMP水平升高会抑制促炎介质生成、吞噬和杀菌等宿主防御功能，但吞噬性巨噬细胞中cAMP生成的空间与动力学特征尚不清楚。本研究采用基于Förster共振能量转移（FRET）的cAMP生物传感器，在活巨噬细...
磷脂酸（PA）是质膜中的主要磷脂之一。尽管已有报道表明 PA 在细胞存活和形态中发挥关键作用，但在活细胞中 PA 何时、何地产生仍不清楚。基于 Förster 共振能量转移（FRET）原理，作者构建了 PA 生物传感器并命名为 Pii（phosphatidic acid indicator）。该传感器将 DOCK2 的脂质结合域夹在...
Mizutani 等开发了一种高灵敏、高特异的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，用于在活细胞中定量检测 BCR-ABL 激酶活性及其对药物的响应。该传感器以 BCR-ABL 主要底物 CrkL 为识别元件，将其夹在黄色荧光蛋白 Venus 与增强青色荧光蛋白 ECFP 之间；当 BCR-ABL 激酶活性升高时，CrkL 酪氨酸...
本研究探索了一类新型生物传感器的通用价值，该传感器可选择性可视化位于细胞表面的特定膜蛋白分子。该体系利用近期报道的双组分荧光模块，由荧光激活蛋白（FAP）和小分子荧光素组成；荧光素在与 FAP 非共价结合后荧光显著增强。作者构建了表达单跨膜重组膜蛋白的细胞，其质膜外侧展示 FAP，胞内侧展示 EGFP 或 mRFP，并用荧光显微镜观...