膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）是一种膜锚定胶原酶，主要参与细胞外基质蛋白的机械降解，并在多种癌症中上调，其迁移与侵袭中的协调功能仍不清楚。本文利用一种特异性识别MT1-MMP的细胞内Förster共振能量转移（FRET）生物传感器，对侵袭性HT-1080活细胞进行成像。该传感器由MT1-MMP特异性底物与mOrange2和m...
Ras/Raf/MEK/ERK 是保守信号通路，ERK1/2 是垂体功能受多种胞外信号调控的整合点。作者此前发现 GTP 酶 Ras 和 Rap1 在 EGF 或 cAMP 依赖性神经肽 VIP 调控 ERK1/2 依赖的催乳素转录中起关键作用。本研究在垂体 GH4C1 细胞系中使用基于 FRET 的 ERK 活性生物传感器 EKA...
遗传编码的Förster共振能量转移（FRET）传感器是现代细胞生物学的重要工具，其构象变化会改变供体-受体发射比，从而在时间和空间上监测靶分子变化及酶活性。FRET传感器广泛用于追踪磷酸化事件和钙离子升高。本文首次将体外与细胞内FRET测量和小角X射线散射（SAXS）相结合，在低分辨率水平上分析传感器功能相关的构象变化。研究系统表...
环磷酸腺苷（cAMP）是多种G蛋白偶联受体（GPCR）的第二信使，也是评价GPCR特异性配体生物活性的有用读出分子。本文报道了一种基于Förster共振能量转移（FRET）的cAMP生物传感器Epac2-camps，并将其与杆状病毒BacMam转导系统相结合。所构建的BacMam-Epac2-camps病毒转导系统可简便、稳健地在多...
蛋白激酶A（PKA）是细胞信号转导的关键调控酶，可磷酸化多种靶蛋白，并被A-激酶锚定蛋白（AKAP）家族在空间上锚定。AKAR2是一种活细胞FRET生物传感器，当被PKA磷酸化时产生荧光共振能量转移信号。AKAP5是AKAP家族重要成员，可锚定PKA、磷酸二酯酶PDE4D及G蛋白偶联受体（GPCR），并介导GPCR向ERK1/2的M...
免疫球蛋白E（IgE）介导过敏反应，其Fc区与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面高亲和受体FcεRI的结合是过敏致敏与细胞激活的关键步骤。为在溶液中监测人IgE Fc（IgEFc）的构象及其受体结合时的变化，作者构建了基于Förster共振能量转移（FRET）的荧光生物传感器，将增强绿色荧光蛋白（eGFP）和单体红色荧光蛋白（mRFP）分别...
分子氧（O2）是所有专性和兼性需氧原核及真核生物的关键代谢物，在能量稳态中起核心作用；缺氧则广泛影响多种生理和病理生理过程。因此，实时监测细胞内氧水平是分析活细胞和组织中缺氧诱导过程的基本前提。本研究开发了一种遗传编码的 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器，用于观察活细胞内分子氧浓度的动态变化。该传感器命名为 Flu...
成骨细胞在负载驱动骨形成中起关键作用，可通过骨细胞机械传感信号激活 Wnt 通路，但其对机械刺激的响应及小 GTPase RhoA 在机械转导中的作用尚不清楚。本研究以 MC3T3-E1 成骨样细胞为模型，在 10 dyn/cm² 单向流体剪切应力处理 1 h 条件下，检验 RhoA 信号是否介导细胞对流动剪切应力的响应。通过全基因...
上皮组织在形态发生、修复和更新过程中发生广泛的集体运动。上皮细胞集体迁移需要细胞间协调细胞-细胞黏附并建立前后极性，同时维持顶底极性，但其分子机制尚不清楚。作者利用 RNA 干扰筛选鉴定人支气管上皮细胞集体迁移所需的 Rho 家族 GTP 酶调节因子，发现肌球蛋白-IXA（Myo9a）。在集体迁移细胞中敲低兼具 RhoGAP 和肌动...
本研究建立了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的高通量内皮细胞凋亡检测方法。作者将 caspase-3 特异性 FRET 生物传感器 C3（CFP-DEVD-YFP）稳定转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC），构建 HUVEC-C3 细胞系。正常状态下 CFP 激发后能量转移至 YFP，细胞呈绿色荧光；当紫外线或紫杉醇等凋亡诱导剂激活...
本研究利用组成性表达 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器的 Madin-Darby 犬肾（MDCK）细胞，实时监测上皮囊泡形成过程中 Rac1 的时空活性。作者将传统 Raichu 探针中的 CFP 替换为 TFP1，降低与 GFP 序列同源导致的基因组内重组，从而建立稳定表达 Raichu-Rac1、Raichu-...
肿瘤信号转导通路的组成分子是抗癌药物的重要靶点。尽管已有大量关于这些分子性质的知识，但信号分子在活细胞中的时空调控仍不清楚。基于荧光共振能量转移（FRET）原理的生物传感器已被开发用于在活细胞中可视化信号分子活性。然而，高灵敏度FRET生物传感器开发困难，限制了其在癌症研究中的广泛应用；缺乏稳定表达FRET生物传感器的细胞系也制约了...
本文提供了在单通道和多通道成像模式下对Rho家族GTPase生物传感器进行活细胞成像的实验程序。多通道方法可在单个活细胞中直接同时可视化两种生物传感器读数。作者以基于CFP/YFP FRET的RhoA生物传感器和基于溶剂极性敏感有机染料的Cdc42生物传感器为例，系统列出实现双比率型生物传感器成像所需的光学组件、滤光片、二向色镜、分...
机械力已知可调节Jun N端激酶（JNK）信号级联，但此前对机械应力激活JNK的分析主要依赖体外检测方法，活细胞中JNK如何响应机械应力及其功能仍不清楚。本研究利用荧光寿命成像显微镜（FLIM）和分子内磷酸化依赖的dJun-FRET生物传感器，实时评估果蝇S2R+细胞中JNK通路活性。定量FRET-FLIM分析与共聚焦显微镜显示，机...
自然杀伤（NK）细胞通过运动、识别和定向分泌等依赖细胞骨架重排的过程杀伤肿瘤和病毒感染细胞。Rho GTPase Cdc42 协调多种受体下游的细胞骨架重组。作者假设 NK 细胞与靶细胞相互作用时 Cdc42 活性可能发生振荡。利用 Cdc42 荧光共振能量转移（FRET）生物传感器和荧光寿命成像（FLIM），在活 YTS NK 细...
基于荧光蛋白（FP）的分子内 Förster 共振能量转移（FRET）生物传感器可在活细胞中可视化多种生化事件。构建此类传感器需要在两种不同颜色 FP 之间插入经过选择的分子识别元件。当识别元件与目标分析物相互作用并发生构象变化时，由于 FRET 效率改变，构建体的比率发射信号发生变化。此类传感器的灵敏度与比率发射变化成正比，因此迫...
本研究设计了一种新装置，可在柔性弹性凝胶上产生局部机械振动，从而在亚细胞位置对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行机械刺激。采用基于荧光共振能量转移（FRET）的钙生物传感器（改良型 Cameleon，以 ECFP 和 YPet 为供体/受体）监测机械刺激下细胞内钙浓度的时空分布。结果显示，多数细胞在机械刺激后出现覆盖整个细胞体的胞内...
基于荧光共振能量转移（FRET）的分子生物传感器是研究活细胞中蛋白活性的重要工具，但因其固有的细胞复杂性和三维成像挑战，很少用于完整生物体。本文提供在早期发育中使用单链分子内 FRET 生物传感器的实验方案，给出胚胎 FRET 比值成像的通用流程，包括数据采集条件和比值图像生成算法。作者以 pRaichu RacFRET 生物传感器...
上皮性卵巢癌（EOC）是致死率最高的妇科恶性肿瘤，部分原因是其临床隐匿性转移。理解 EOC 扩散和侵袭机制可能提供抗转移治疗新靶点或转移病检测新方法。cAMP 依赖性蛋白激酶（PKA）在 EOC 中常失调，且 PKA 活性和通过 A 激酶锚定蛋白（AKAPs）的亚细胞定位是细胞骨架动力学和细胞迁移的重要调节因子。因此，我们研究 PK...
微管亲和力调节激酶（MARK）/Par-1 家族蛋白激酶在细胞极性建立、细胞周期调控和胞内信号转导中发挥重要作用，其功能紊乱与癌症及脑疾病（如无脑回畸形和阿尔茨海默病）相关。为阐明 MARK 家族激酶的生物学作用，作者筛选特异性抑制剂并开发 MARK 活性生物传感器。对约 18000 个化合物的 ChemBioNet 库进行筛选，获...