本文设计并合成了一种用于硫醇快速光学传感的新型荧光开启探针。该探针以 BODIPY 为荧光骨架，通过 Knoevenagel 反应在苯乙烯基 BODIPY 上引入 2,4-二硝基苯磺酸酯基团。由于强吸电子的 2,4-二硝基苯磺酸酯引发供体激发态光诱导电子转移（d-PeT），探针在未反应状态下荧光被有效淬灭；当与硫醇接触时，硫醇通过亲...
CyclinB1-Cdk1激酶是有丝分裂促进因子（MPF）的核心催化活性，但其在哺乳动物细胞中何时以及以何种速度激活仍不清楚。作者开发了一种特异性识别CyclinB1-Cdk1的FRET生物传感器，可在活人细胞中以高时间分辨率检测其激酶活性。该传感器由mCerulean供体、YPet受体、CyclinB1自磷酸化位点连接肽和Plk1...
自早期分裂细胞示意图以来，借助多种互补方法，真核细胞及其细胞周期状态的表征已取得显著进展。传统方法多依赖细胞固定，以鉴定细胞裂解液、培养细胞或组织中的分子组分；绿色荧光蛋白（GFP）技术的发展使几乎任何融合蛋白都能在细胞内和体内被可视化，并利用具有明确时空特征的功能元件，发展出遗传编码的细胞周期相位荧光标记，从而以高分辨率实时表征活...
JNK 介导的信号通路可将应激刺激和细胞因子等信号转导为凋亡、增殖、分化与炎症等功能反应。为在细胞内环境中刻画该通路的动态信息流与信号处理，作者构建了一种基因编码的荧光蛋白生物传感器 JNKAR1（JNK activity reporter），用于检测内源性 JNK 活性。该传感器基于磷酸化依赖的 FRET 变化：当 JNK 磷酸化...
Src激酶和膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）在肿瘤侵袭与转移中均起关键作用，但二者在致癌性表皮生长因子（EGF）刺激下如何时空协调尚不清楚。本研究将两对光谱不同的荧光共振能量转移（FRET）对——CFP/YFP与mOrange2/mCherry——组合，在单个活细胞中同时可视化Src和MT1-MMP活性。作者先在体外和哺乳动物...
本文报道了一种基于荧光各向异性的时间分辨FRET显微成像方法，用于动态监测活T细胞中Rac1活性。作者利用由增强绿荧光蛋白（eGFP）和单体红荧光蛋白（mRFP1）构成的Raichu生物传感器，通过供体-受体间FRET效率变化反映Rac1构象与活性。该传感器被表达于Jurkat T细胞中，细胞表面CD3受体与包被抗CD3抗体的玻璃底...
细胞凋亡是许多生物学研究的核心问题，但缺乏能够以无毒、非侵入方式连续监测凋亡或细胞活力的方法。本文报道了一种适用于活细胞成像的工具，可在不扰动细胞环境的情况下实时可视化凋亡变化。作者设计了一种极性敏感的 annexin 基生物传感器（pSIVA），其具有可切换的荧光状态，仅当结合凋亡细胞时产生信号。利用 pSIVA 进行活细胞成像，...
随着药物发现项目增多，在健康与病理细胞中以高时空分辨率可视化和监测生物活动变得至关重要。为此，能够报告特定胞内靶标水平与活性的探针和传感器成为必需。绿色荧光蛋白（GFP）的发现、GFP 报告系统的发展、小分子荧光探针的合成进展以及荧光成像技术的快速进步，使生物传感器领域出现了大量可用于复杂生物样品、活细胞和组织的荧光报告系统，用于探...
Rac1、RhoA 和 Cdc42 等 Rho 家族 GTPase 协同调控细胞骨架动态，但它们在单个细胞突出事件中秒级、微米级的时空协调仍不清楚。本研究在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中，利用两种 GTPase 荧光生物传感器的同步成像，以及一种以突出/回缩事件为共同时间参考的“计算多重化”方法，分别测定 Rac1、Cdc42 和 ...
肠道病毒感染可显著关闭宿主蛋白合成，该过程主要由病毒 2A 蛋白酶（2Apro）切割真核翻译起始因子 eIF4GI 和 eIF4GII 介导。本研究基于荧光共振能量转移（FRET）开发了遗传编码的 FRET 生物传感器，用于在完整细胞中可视化和定量该特异性蛋白水解过程。通过稳定表达由绿色荧光蛋白 2（GFP2）和红色荧光蛋白 2（D...
信号转导研究因遗传编码FRET生物传感器的快速发展而发生范式转变。这类传感器利用一对适合FRET的荧光蛋白，将激酶磷酸化或第二信使浓度变化等信号事件转化为融合蛋白的构象变化，并通过供体与受体荧光强度比的变化进行实时检测。激酶活性报告器通常由激酶特异性底物、磷酸氨基酸结合域和两侧荧光蛋白组成；第二信使传感器则依赖配体结合域在结合Ca2...
膜筏和小窝蛋白作为信号平台受到关注，尤其在 HIV、神经及心血管疾病发病机制中的作用。β-肾上腺素受体（β-AR）介导的环磷酸腺苷（cAMP）信号是膜筏研究重点，因为该通路多个组分被膜微区室化，但膜筏如何在细胞环境中调控信号动力学仍不清楚。本文报道一种基于单细胞实时荧光成像的活细胞检测方法，利用改进的 FRET 型 cAMP 生物传...
p21激活激酶1（PAK1）是Cdc42和Rac1 GTP酶的关键效应子，通过调控肌动蛋白细胞骨架和黏附动态控制细胞突起与运动，其失调与人类癌症相关。本文报道了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的PAK1构象生物传感器，用于在活细胞中直接观察PAK1激活的动态过程。该传感器由YFP、PAK1 C端片段和CFP融合组成，PAK1激活...
不同颜色荧光蛋白之间的 Förster（荧光）共振能量转移（FRET）为设计和构建用于检测胞内事件的生物传感器提供了稳健基础。目前，已开发出一系列针对生物相关离子、分子和特定酶活性的 FRET 型生物传感器，并用于研究细胞生物学中的诸多问题。FRET 型生物传感器使用的一个新兴趋势是将其与第二种生物传感器联用，从而在单个活细胞中同时...
Src 是非受体酪氨酸激酶，参与细胞迁移、增殖和存活等过程，其活性受亚细胞定位精细调控。质膜并非均一，富含胆固醇、鞘磷脂和饱和脂肪酸的脂筏可作为信号平台，但 Src 在脂筏与非脂筏区室的调控机制仍不清楚，且传统去垢剂提取脂筏存在争议。为在活细胞中实时可视化局部 Src 活性，作者将基于 FRET 的 Src 生物传感器与膜靶向标签偶...
基因编码荧光蛋白可作为监测细胞过程的理想报告分子，因为它们可通过与目标蛋白融合而靶向任意亚细胞区域。本文报道了一种pH敏感荧光蛋白E1GFP，其适合以高时空分辨率实时监测动态细胞器内的pH变化。E1GFP是一种基于发射的比率型pH指示剂，pK接近6.0。作者将其应用于内体-溶酶体途径中pH变化的测量。通过将E1GFP与具有细胞穿透能...
多磷酸肌醇是含量低于总磷脂1%的少数磷脂，却参与多种信号转导和膜运输事件。磷脂酰肌醇4-磷酸（PtdIns4P）是最丰富的多磷酸肌醇，周转迅速，但其在细胞或植物中的具体分布仍不清楚。本文报道了一种用于监测活植物细胞中PtdIns4P动态的脂质生物传感器。该传感器由荧光蛋白与特异性结合PtdIns4P的脂质结合域融合而成，即人FAPP...
基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码生物传感器能够以高时空分辨率在活细胞中可视化信号事件，但其灵敏度有限，限制了广泛应用。本研究将增强型青色荧光蛋白（ECFP）与黄色荧光蛋白变体 YPet 配对，构建 ECFP/YPet FRET 对。该 FRET 对可显著提高多种信号分子生物传感器的灵敏度，包括酪氨酸激酶 Src、小 GTP...
基于荧光共振能量转移（FRET）的遗传编码生物传感器已被广泛用于以高时空分辨率可视化活细胞中的分子活性，但生物传感器蛋白的快速扩散会阻碍真实分子激活图的精确重建。作者基于荧光漂白后恢复（FRAP）实验，发展了一种有限元（FE）方法，用于分析、模拟并扣除可移动生物传感器的扩散效应。该方法被应用于分析定位于不同亚细胞区室的 Src FR...
基于 Förster 共振能量转移（FRET）的生物传感器可用于定量分析细胞内信号，包括环腺苷酸（cAMP）监测，受到广泛关注。串联生物传感器在供体激发波长下测量供体/受体发射比是常用方法，但该比值不仅随 cAMP 浓度变化，还会受离子环境或其他影响荧光蛋白折叠概率的因素影响。本文采用基于两种激发波长的光谱 FRET 分析方法，利用...