Visualization of PKA activity in plasma membrane microdomains.
膜筏是富含鞘脂和胆固醇的质膜微区，其中动态排列多种信号蛋白。cAMP/蛋白激酶A（PKA）通路的多个组分，包括β-肾上腺素受体（β-AR）、G蛋白和腺苷酸环化酶（AC），在膜筏与非筏区域呈差异定位。由于PKA参与调控多种基本细胞功能，且许多功能依赖膜筏，理解PKA活性如何被这些质膜微区特异性调节具有重要意义。为此，作者开发了改进的F...
Transient increase in cyclic AMP localized to macrophage phagosomes.
环磷酸腺苷（cAMP）调控多种生物学过程与细胞功能，其胞内空间梯度日益受到重视。既往研究表明，巨噬细胞吞噬过程中会产生cAMP，且cAMP水平升高会抑制促炎介质生成、吞噬和杀菌等宿主防御功能，但吞噬性巨噬细胞中cAMP生成的空间与动力学特征尚不清楚。本研究采用基于Förster共振能量转移（FRET）的cAMP生物传感器，在活巨噬细...
Heterogeneity of phosphatidic acid levels and distribution at the plasma membrane in living cells as visualized by a Föster resonance energy transfer (FRET) biosensor.
磷脂酸（PA）是质膜中的主要磷脂之一。尽管已有报道表明 PA 在细胞存活和形态中发挥关键作用，但在活细胞中 PA 何时、何地产生仍不清楚。基于 Förster 共振能量转移（FRET）原理，作者构建了 PA 生物传感器并命名为 Pii（phosphatidic acid indicator）。该传感器将 DOCK2 的脂质结合域夹在...
Fluorescence resonance energy transfer biosensors for cancer detection and evaluation of drug efficacy.
Mizutani 等开发了一种高灵敏、高特异的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，用于在活细胞中定量检测 BCR-ABL 激酶活性及其对药物的响应。该传感器以 BCR-ABL 主要底物 CrkL 为识别元件，将其夹在黄色荧光蛋白 Venus 与增强青色荧光蛋白 ECFP 之间；当 BCR-ABL 激酶活性升高时，CrkL 酪氨酸...
Fluorogen-activating proteins as biosensors of cell-surface proteins in living cells.
本研究探索了一类新型生物传感器的通用价值，该传感器可选择性可视化位于细胞表面的特定膜蛋白分子。该体系利用近期报道的双组分荧光模块，由荧光激活蛋白（FAP）和小分子荧光素组成；荧光素在与 FAP 非共价结合后荧光显著增强。作者构建了表达单跨膜重组膜蛋白的细胞，其质膜外侧展示 FAP，胞内侧展示 EGFP 或 mRFP，并用荧光显微镜观...
Design and synthesis of a highly selective fluorescent turn-on probe for thiol bioimaging in living cells.
本文设计并合成了一种用于硫醇快速光学传感的新型荧光开启探针。该探针以 BODIPY 为荧光骨架，通过 Knoevenagel 反应在苯乙烯基 BODIPY 上引入 2,4-二硝基苯磺酸酯基团。由于强吸电子的 2,4-二硝基苯磺酸酯引发供体激发态光诱导电子转移（d-PeT），探针在未反应状态下荧光被有效淬灭；当与硫醇接触时，硫醇通过亲...
Progressive activation of CyclinB1-Cdk1 coordinates entry to mitosis.
CyclinB1-Cdk1激酶是有丝分裂促进因子（MPF）的核心催化活性，但其在哺乳动物细胞中何时以及以何种速度激活仍不清楚。作者开发了一种特异性识别CyclinB1-Cdk1的FRET生物传感器，可在活人细胞中以高时间分辨率检测其激酶活性。该传感器由mCerulean供体、YPet受体、CyclinB1自磷酸化位点连接肽和Plk1...
Visualization of JNK activity dynamics with a genetically encoded fluorescent biosensor.
JNK 介导的信号通路可将应激刺激和细胞因子等信号转导为凋亡、增殖、分化与炎症等功能反应。为在细胞内环境中刻画该通路的动态信息流与信号处理，作者构建了一种基因编码的荧光蛋白生物传感器 JNKAR1（JNK activity reporter），用于检测内源性 JNK 活性。该传感器基于磷酸化依赖的 FRET 变化：当 JNK 磷酸化...
Simultaneous visualization of protumorigenic Src and MT1-MMP activities with fluorescence resonance energy transfer.
Src激酶和膜型1基质金属蛋白酶（MT1-MMP）在肿瘤侵袭与转移中均起关键作用，但二者在致癌性表皮生长因子（EGF）刺激下如何时空协调尚不清楚。本研究将两对光谱不同的荧光共振能量转移（FRET）对——CFP/YFP与mOrange2/mCherry——组合，在单个活细胞中同时可视化Src和MT1-MMP活性。作者先在体外和哺乳动物...
Time-lapse FRET microscopy using fluorescence anisotropy.
本文报道了一种基于荧光各向异性的时间分辨FRET显微成像方法，用于动态监测活T细胞中Rac1活性。作者利用由增强绿荧光蛋白（eGFP）和单体红荧光蛋白（mRFP1）构成的Raichu生物传感器，通过供体-受体间FRET效率变化反映Rac1构象与活性。该传感器被表达于Jurkat T细胞中，细胞表面CD3受体与包被抗CD3抗体的玻璃底...
Engineering a polarity-sensitive biosensor for time-lapse imaging of apoptotic processes and degeneration.
细胞凋亡是许多生物学研究的核心问题，但缺乏能够以无毒、非侵入方式连续监测凋亡或细胞活力的方法。本文报道了一种适用于活细胞成像的工具，可在不扰动细胞环境的情况下实时可视化凋亡变化。作者设计了一种极性敏感的 annexin 基生物传感器（pSIVA），其具有可切换的荧光状态，仅当结合凋亡细胞时产生信号。利用 pSIVA 进行活细胞成像，...
Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion.
Rac1、RhoA 和 Cdc42 等 Rho 家族 GTPase 协同调控细胞骨架动态，但它们在单个细胞突出事件中秒级、微米级的时空协调仍不清楚。本研究在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中，利用两种 GTPase 荧光生物传感器的同步成像，以及一种以突出/回缩事件为共同时间参考的“计算多重化”方法，分别测定 Rac1、Cdc42 和 ...
Visualizing and quantifying the differential cleavages of the eukaryotic translation initiation factors eIF4GI and eIF4GII in the enterovirus-infected cell.
肠道病毒感染可显著关闭宿主蛋白合成，该过程主要由病毒 2A 蛋白酶（2Apro）切割真核翻译起始因子 eIF4GI 和 eIF4GII 介导。本研究基于荧光共振能量转移（FRET）开发了遗传编码的 FRET 生物传感器，用于在完整细胞中可视化和定量该特异性蛋白水解过程。通过稳定表达由绿色荧光蛋白 2（GFP2）和红色荧光蛋白 2（D...
The role of membrane microdomains in shaping beta2-adrenergic receptor-mediated cAMP dynamics.
膜筏和小窝蛋白作为信号平台受到关注，尤其在 HIV、神经及心血管疾病发病机制中的作用。β-肾上腺素受体（β-AR）介导的环磷酸腺苷（cAMP）信号是膜筏研究重点，因为该通路多个组分被膜微区室化，但膜筏如何在细胞环境中调控信号动力学仍不清楚。本文报道一种基于单细胞实时荧光成像的活细胞检测方法，利用改进的 FRET 型 cAMP 生物传...
Dissecting activation of the PAK1 kinase at protrusions in living cells.
p21激活激酶1（PAK1）是Cdc42和Rac1 GTP酶的关键效应子，通过调控肌动蛋白细胞骨架和黏附动态控制细胞突起与运动，其失调与人类癌症相关。本文报道了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的PAK1构象生物传感器，用于在活细胞中直接观察PAK1激活的动态过程。该传感器由YFP、PAK1 C端片段和CFP融合组成，PAK1激活...
Visualization of Src activity at different compartments of the plasma membrane by FRET imaging.
Src 是非受体酪氨酸激酶，参与细胞迁移、增殖和存活等过程，其活性受亚细胞定位精细调控。质膜并非均一，富含胆固醇、鞘磷脂和饱和脂肪酸的脂筏可作为信号平台，但 Src 在脂筏与非脂筏区室的调控机制仍不清楚，且传统去垢剂提取脂筏存在争议。为在活细胞中实时可视化局部 Src 活性，作者将基于 FRET 的 Src 生物传感器与膜靶向标签偶...
Real-time measurement of endosomal acidification by a novel genetically encoded biosensor.
基因编码荧光蛋白可作为监测细胞过程的理想报告分子，因为它们可通过与目标蛋白融合而靶向任意亚细胞区域。本文报道了一种pH敏感荧光蛋白E1GFP，其适合以高时空分辨率实时监测动态细胞器内的pH变化。E1GFP是一种基于发射的比率型pH指示剂，pK接近6.0。作者将其应用于内体-溶酶体途径中pH变化的测量。通过将E1GFP与具有细胞穿透能...
Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells.
多磷酸肌醇是含量低于总磷脂1%的少数磷脂，却参与多种信号转导和膜运输事件。磷脂酰肌醇4-磷酸（PtdIns4P）是最丰富的多磷酸肌醇，周转迅速，但其在细胞或植物中的具体分布仍不清楚。本文报道了一种用于监测活植物细胞中PtdIns4P动态的脂质生物传感器。该传感器由荧光蛋白与特异性结合PtdIns4P的脂质结合域融合而成，即人FAPP...
Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.
基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码生物传感器能够以高时空分辨率在活细胞中可视化信号事件，但其灵敏度有限，限制了广泛应用。本研究将增强型青色荧光蛋白（ECFP）与黄色荧光蛋白变体 YPet 配对，构建 ECFP/YPet FRET 对。该 FRET 对可显著提高多种信号分子生物传感器的灵敏度，包括酪氨酸激酶 Src、小 GTP...
The spatiotemporal pattern of Src activation at lipid rafts revealed by diffusion-corrected FRET imaging.
基于荧光共振能量转移（FRET）的遗传编码生物传感器已被广泛用于以高时空分辨率可视化活细胞中的分子活性，但生物传感器蛋白的快速扩散会阻碍真实分子激活图的精确重建。作者基于荧光漂白后恢复（FRAP）实验，发展了一种有限元（FE）方法，用于分析、模拟并扣除可移动生物传感器的扩散效应。该方法被应用于分析定位于不同亚细胞区室的 Src FR...